SIFORTI

Sicurezza Igienica di Formaggi Tipici Italiani


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GEFORPASTA
Genuinità di Formaggi Italiani a Pasta Filata


Coordinatore: Dr. Germano Mucchetti
Istituto Sperimentale Lattiero Caseario - MiPAF
gmucchetti@ilclodi.it


English Version



Descrizione Progetto
Risultati I Semestre linea SIFORTI
Risultati I Semestre linea GEFORPASTA
Risultati Finali linea SIFORTI
Risultati Finali linea GEFORPASTA
Unità Operative linea SIFORTI
Unità Operative linea GEFORPASTA
Budget





Descrizione Progetto

I formaggi a pasta cotta lungamente stagionati (Grana Padano e Pecorino Romano) ed a pasta filata (Mozzarelle e Caciocavallo Silano) sono prodotti tipicamente legati all'agricoltura ed alla tradizione dell'Italia. Mentre è discussa a livello internazionale (USA, Australia) la sicurezza igienica dei primi, essendo prodotti con latte crudo, per le paste filate esiste la concorrenza sleale di formaggi prodotti con addizione non autorizzata di caseine od altri derivati lattieri in polvere. Il progetto Sicurezza e Salubrità dei prodotti caseari è quindi articolato in due linee di ricerca: SIFORTI "Sicurezza Igienica di Formaggi Tipici Italiani" e GEFORPASTA "Genuinità di Formaggi Italiani a Pasta Filata".

La linea SIFORTI vuole dimostrare che la tecnica di produzione e le caratteristiche chimico-fisiche di questi formaggi sono tali da impedire sopravvivenza, sviluppo o produzione di tossine da parte di microrganismi patogeni (Salmonella spp, Listeria monocytogenes , Staphylococcus aureus e Escherichia coli O157:H7) eventualmente presenti nel latte da cui derivano e quindi ne garantiscono la sicurezza igienica.

La linea GEFORPASTA ha per scopo il riconoscimento dell'uso di proteine essiccate in formaggi a pasta filata, non ammesso rispettivamente dalla legislazione europea (per caseine e caseinati) e dai disciplinari di produzione dei formaggi a denominazione di origine protetta (DOP) o con attestazione di specificità (per proteine del latte). Si cercherà di semplificare ed ottimizzare la ricerca di lisinoalanina (LAL), e di individuare altre molecole derivanti da modificazioni della proteina lattiera conseguenti al processo di produzione ed essiccazione e metterne a punto le metodiche di analisi.












Risultati I Semestre linea SIFORTI

Coerentemente con gli obiettivi del primo anno di ricerca è iniziata l’analisi di formaggi Grana Padano e Pecorino Romano a differenti periodi di stagionatura ma comunque pronti per il consumo.

Il Consorzio di Tutela del Grana Padano in accordo per il piano di campionamenti stabilito con l'Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna (IZSLER) di Brescia, DISTAM dell’Università di Milano, CHELAB srl, ed il Consorzio di Tutela del Pecorino Romano in accordo con Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna (IZS S) ed Istituto Zoootecnico e Caseario per la Sardegna (IZCS) hanno iniziato a fornire i campioni alle predette Unità Operative che hanno in carico di definire le caratteristiche microbiologiche e chimico-fisiche. Dopo analisi di circa un terzo dei campioni preventivati (200 Grana Padano e 100 Pecorino Romano) non è stata riscontrata presenza di flora patogena (Salmonella spp, Listeria monocytogenes ) né di flora indicatrice di carenza d’igiene (es. Escherichia coli). Le caratteristiche chimico-fisiche dei formaggi rientrano nella norma e confortano il significato dell’assenza di tale flora nei campioni finora analizzati.

Questi primi risultati confermano quanto atteso sulla base della mancanza di dati di letteratura che attestassero il contrario, ma non sono sicuramente sufficienti per dimostrare la sicurezza di Grana Padano prodotto da latte crudo e di Pecorino Romano prodotto da latte termizzato o crudo, ragione per cui è prevista la dimostrazione diretta della sicurezza di questi formaggi attraverso la produzione sperimentale di formaggi con latte volontariamente contaminato con batteri patogeni ( Salmonella spp, Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus enetrotossinogeni ed Escherichia coli produttori di tossine Shiga I e II).

A tal fine Consorzi, IZS, IZCS e l’Istituto Sperimentale Lattiero Caseario di Lodi (ILC) stanno procedendo ad individuare i caseifici ove realizzare caseificazioni sperimentali con aggiunta di colture dei citati batteri e le condizioni di produzione salatura e stagionatura dei formaggi atte a garantire la sicurezza degli operatori e dell’ambiente.

Per poter procedere a queste caseificazioni in modo scientificamente corretto e poter poi dimostrare che la sicurezza dei formaggi è data dalla loro particolare tecnica produttiva indipendentemente dall’uso della pastorizzazione del latte si stanno mettendo a punto presso distinte Unità Operative metodi e sistemi per:
A) poter definire il livello di inoculo del latte con le colture dei batteri patogeni
B) identificare la presenza nel formaggio di numeri anche molto contenuti di cellule batteriche anche stressate
C) escludere la presenza di tossine eventualmente formate da batteri patogeni nelle fasi del processo produttivo (affioramento della crema, stoccaggio del latte ecc.) precedenti la trasformazione casearia.

Livello di inoculo
ILC sta studiando le cinetiche di crescita di colture dei ceppi citati in latte scremato ed intero sottoposto ad affioramento del grasso in differenti condizioni di temperatura previste dal piano dei controlli della produzione di Grana Padano e per tempi differenti che possano simulare condizioni differenti di raccolta e stoccaggio del latte. In alcune fra le condizioni studiate, caratterizzate da temperature più elevate e tempi più lunghi, le flore testate si sono dimostrate in grado di duplicarsi e crescere.
Un possibile effetto dei pretrattamenti subiti dal substrato (latte crudo, pastorizzato o sterile) sulle cinetiche di crescita di tali microrganismi è stato visto ed è in fase di conferma e possibile quantificazione.

Sensibilità della determinazione della presenza di cellule anche stressate
Il Dipartimento di Scienza degli Alimenti dell’Università degli Studi di Napoli "Federico II" (DSA) ha ottimizzato un protocollo di estrazione del DNA microbico da colture in latte, con popolazioni scalari da 1 cellula a 108 cellule ml -1 , introducendo trattamenti enzimatici e chimici modificati rispetto a quanto previsto per l’applicazione del Wizard DNA purification kit della Promega. L’estrazione del DNA è stata effettuata sia dalle diluizioni delle colture tal quali sia da colture di arricchimento ottenute dalle stesse. Il rilevamento mediante PCR è stato eseguito targettando, per Listeria monocytogenes , il gene hlyA, per Staphylococcus aureus il gene hsp60 per la chaperonina da 60 kda ed i geni per tutte le enterotossine, per Escherichia coli O157:H7 i geni stx1, stx2, eae, hlyA e rfbE (O157:H7).
Con tale metodica, dopo arricchimento delle diluizioni delle colture, è risultato possibile rilevare anche una sola cellula per ml.
Ottenuta quindi una sufficiente sensibilità di determinazione della presenza di cellule, DSA sta procedendo alla valutazione di protocolli di rivivificazione di cellule subletalmente danneggiate da stress imputabili a concentrazioni di NaCl, acidità e trattamenti termici, quali quelli potenzialmente presenti nelle produzioni casearie allo studio.


Presenza di tossine batteriche
Il Centro di Spettrometria di Massa Proteomica e Biomolecolare (CESMA-ProBio) dell’Istituto di Scienze dell'Alimentazione del CNR di Avellino ed una seconda unità del Dipartimento di Scienza degli Alimenti dell’Università degli Studi di Napoli (DSA) hanno messo a punto un protocollo di analisi di applicabilità generale, usando come sistema modello l’enterotossina B prodotta da S. aureus .
L’elettroforesi SDS-PAGE con colorazione al nitrato d’argento ha permesso la rivelazione di minime quantità di tossina (50-100 ng).
Parallelamente sono state ottimizzate sia la separazione cromatografica che le condizioni di identificazione in spettrometria di massa, mediante accoppiamento HPLC-MS.
Sono state quindi valutate differenti tecniche di spettrometria di massa: MALDI-TOF-MS, ESI-MS e ESI-MS/MS.
Al MALDI è stato possibile rivelare la proteina anche alla conc. di 180 fmol/ul, mentre con la tecnica ESI-MS si sono registrati gli spettri di massa delle due soluzioni più concentrate (35 e 3.5 pmol/ul). La massa misurata con ESI-MS della enterotossina stafilococcica B è stata pari a 28369.15 Da.

Al fine di poter disporre di un metodo più sensibile di dosaggio della presenza della tossina B la tossina è stata degradata enzimaticamente a peptidi, di cui è stata fatta la caratterizzazione mediante HPLC-MS peptide mapping.
È stato quindi affrontato il problema di determinare la presenza della tossina in una matrice complessa quale il latte.

Conclusioni
L’insieme del lavoro delle Unità Operative nei primi 6 mesi di attività sta creando le premesse per conseguire gli obiettivi preposti. La definizione del livello massimo e del momento di inoculo del latte con le colture dei batteri patogeni permetterà di produrre formaggio nella condizione più favorevole per la possibile crescita della microflora patogena nel formaggio. La possibilità di identificare da un lato la presenza nel formaggio di numeri molto contenuti di batteri patogeni anche stressati e quella dall’altro di escludere la presenza di tossine eventualmente formate da batteri patogeni nelle fasi del processo produttivo saranno elementi di dimostrazione della sicurezza di questi formaggi e quindi di tutela della salute del consumatore.









Risultati I Semestre linea GEFORPASTA

Il progetto GEFORPASTA "Genuinità di Formaggi Italiani a Pasta Filata" ha per oggetto il riconoscimento dell'uso di caseine e/o di proteine del latte come ingrediente dei formaggi a pasta filata Mozzarella e Caciocavallo.
L'utilizzo in caseificazione delle proteine anidre di origine lattiero casearia è regolato da precise leggi comunitarie. In base al Reg. CE 2204/90 le caseine ed i caseinati sono vietati nella produzione di qualunque formaggio ad esclusione dei formaggi fusi, in cui il loro uso è invece consentito dal Reg. CE 2742/90 purchè in quantità non superiore al 5%. La Direttiva CE 92/46 ha aperto invece una via all’addizione di "proteine del latte" al latte per caseificio destinato alla produzione di formaggi generici non tutelati da disciplinari di produzione. Tali proteine sono ottenute industrialmente mediante tecniche di ultrafiltrazione e/o coprecipitazione.

L'obiettivo fondamentale della ricerca è il riconoscimento dell'addizione di tali proteine anidre mediante la ricerca di marcatori molecolari derivanti da modificazioni della proteina conseguenti al suo processo di produzione.
La determinazione della lisinoalanina (LAL) al di sopra di un minimo livello soglia è uno degli strumenti già testati con successo per riconoscere l'addizione di derivati proteici del latte essiccati ai formaggi a pasta filata. Tuttavia lo sviluppo delle tecniche di frazionamento delle proteine del latte e delle tecniche di formulazione degli ingredienti utilizzabili in caseificio può richiedere la individuazione anche di altre molecole marker soprattutto per quei derivati proteici nei quali la formazione di LAL indotta dal processo sia più limitata.
Primo obiettivo del progetto è quindi la verifica di una procedura semplificata di determinazione di LAL per HPLC e rivelazione fluorimetrica dei FMOC derivati: a tal fine DISTAM ha organizzato un training di addestramento al nuovo metodo per le altre UU.OO. (UNINA, ISA e CHELAB) coinvolte nei ring test.
Successivamente DISTAM, UNINA, ISA e CHELAB hanno quindi iniziato ad analizzare una campionatura di 16 diversi derivati proteici essiccati (caseinati, caseine acide, caseine presamiche, proteine del latte a diverso titolo proteico) reperiti da ILC sul mercato e caratterizzati da differenti modalità di produzione e quindi con un potenziale differente contenuto di molecole marker. Al fine quindi di validare il metodo di ricerca della LAL, ILC ha messo a punto la procedura per la produzione di Mozzarelle con aggiunte scalari di caseinato di calcio (da 1 a 0,06 kg per 100 kg latte) ed ha quindi distribuito a tutte le altre UU.OO. campioni di formaggio allo stato congelato. ILC ha scelto di produrre Mozzarelle con la tecnologia di preacidificazione del latte con acido citrico al fine di ridurre al minimo possibili fenomeni di proteolisi e comunque standardizzare al massimo le procedure di caseificazione. Al momento sono in corso le prove di produzione di Mozzarelle per aggiunta al latte di proteine del latte e si sta studiando come poter aggiungere in modo quantitativo la caseina acida e poter quindi produrre Mozzarelle con un contenuto di proteine anidre “estranee” proporzionale al quantitativo aggiunto.
UNINA ed ISA hanno iniziato la ricerca nei campioni di proteine essiccate di altre molecole marker del trattamento produttivo dovute a modificazioni strutturali irreversibili (deamidazione, desolforazione, defosforilazione, o reticolazione di catene proteiche). Parallelamente, sempre UNINA ed ISA stanno preparando anticorpi policlonali contro LAL, di cui al momento stanno valutando la specificità mediante saggi di western blotting, con il fine di rendere ancora più semplice, rapida e meno costosa la sua ricerca.

Conclusioni
I primi 6 mesi di attività di GEFORPASTA hanno permesso di avviare il confronto tra laboratori nell’esecuzione della metodica HPLC per la determinazione di LAL sia in proteine lattiere anidre sia in campioni di formaggio a pasta filata.







Risultati Finali linea SIFORTI

1- Stato dell'arte scientifico e applicativo

Il problema della sicurezza alimentare è una delle tematiche di maggior rilievo nel campo della ricerca ed i risultati della ricerca, a loro volta, possono diventare anche  strumento per aggiornamenti della legislazione e delle pratiche produttive.
Il tema della linea di ricerca ha voluto affrontare solo alcuni aspetti della tematica “sicurezza alimentare” ed in particolare quelli legati alla presenza di pericoli microbiologici in formaggi tipici italiani a lunga stagionatura e, nella fattispecie, la presenza di microrganismi patogeni non sporigeni (Listeria monocytogenes, Salmonella spp, Staphylococcus aureus ed Escherichia coli tossinogeni) e loro tossine, presenza normata dalla Direttiva CE 92/46, recepita in Italia dal DPR 54/1997.
Il sistema europeo ha integrato da tempo le regole sanitarie di produzione dei formaggi con le esigenze di tutelare al contempo anche procedure tradizionali di produzione che potrebbero essere considerate fonte di rischio per il consumatore: in tal senso erano e sono da considerare le deroghe ai requisiti della Direttiva CE 92/46 previste per i formaggi DOP o comunque tradizionali, deroghe concesse proprio perché il legislatore in presenza di metodi di produzione storici, e di cui dovrebbe quindi essere documentata la sicurezza dei prodotti, ha ritenuto di preservare pratiche e strutture produttive potenzialmente a rischio ma importanti per mantenere le caratteristiche originali e quindi  tipiche dei formaggi.
Questa interazione qualità-sicurezza, a maggior ragione in presenza di deroghe, richiede tuttavia che sia dimostrata l’assenza di pericolo, o la sua presenza a livelli accettabili.
Stabilito che ci deve essere dimostrazione, il piano del dibattito si sposta sulla  “qualità” della dimostrazione. La valutazione può essere fatta usando “metri” diversi e può quindi diventare fonte di contrasto tra Autorità Sanitarie di diversi Paesi. Non solo, una valutazione contrastante finalizzata ad assicurare maggior protezione alla sicurezza dei consumatori del  proprio Paese sulla base di standard nazionali, può diventare anche uno strumento per introdurre di fatto limitazioni al libero commercio, e tali limitazioni, a seconda delle interpretazioni, che come è inevitabile sono sempre di parte, potrebbero anche essere considerate barriere commerciali mascherate.  
Se l’Europa, per lo meno quella mediterranea, tutela i formaggi a latte crudo di qualità e  considera “sicuri” quelli a lunga stagionatura grazie alla conoscenza dei processi produttivi ed all’assenza storica di casi di malattia associati al loro consumo, America ed Oceania, pur consentendo ai loro caseifici di utilizzare latte crudo per produrre formaggi con stagionatura superiore a 60 giorni, chiedono, per consentire la libera circolazione delle merci, che sia dimostrata in modo inequivoco la sicurezza dei formaggi prodotti con latte non pastorizzato, e quindi con reazione positiva alla fosfatasi. Anzi, la Food and Drug Administration (FDA) USA sta pensando di sottoporre a norme più restrittive il permesso di produrre formaggi a latte crudo con stagionatura superiore a 60 giorni, definendo appositi profili di rischio: il messaggio che FDA continua a lanciare anche nella sua comunicazione al pubblico (vedi FDA Consumer magazine September-October 2004 Issue)  è chiaro “Got Milk? Make Sure It's Pasteurized”.
Le autorità sanitarie USA infatti spesso realizzano un’equivalenza impropria  tra formaggi con reazione ancora positiva alla fosfatasi alcalina, tipica dei formaggi a latte crudo di vacca quali Grana Padano e Parmigiano Reggiano o dei formaggi ovini a latte termizzato quali il Pecorino Romano, e pericolo per la sicurezza alimentare: sulla base di tale equivalenza bloccano o rallentano quindi le importazioni. Quanto pesi in questa equivalenza il principio di precauzione e quanto la concorrenza industriale ed il protezionismo economico non è discriminazione che spetta al progetto di risolvere.
La Food Standards Australia New Zealand (FSANZ, 2003) ha accettato solo recentemente, e comunque in via provvisoria, il concetto che formaggi a latte crudo a pasta extra dura (con umidità inferiore al 36%), cotti ad almeno 48°C e stagionati per almeno 6 mesi a temperature superiori a 10°C possano essere importati in Oceania senza quarantena perché il loro consumo non comporta rischi per la sicurezza e la salute pubblica.
Se Grana Padano e Parmigiano Reggiano soddisfano appieno questi requisiti, non altrettanto si può dire per il Pecorino Romano la cui temperatura di cottura della cagliata è al massimo di 48°C e la cui stagionatura minima è di 5 mesi.
Un piccolo Paese europeo extracomunitario, la Svizzera, produttore tradizionale di formaggi stagionati a latte crudo e meno tutelato nelle sue transazioni commerciali dal peso di una grande comunità, quale è la UE, ha accettato già da anni  la sfida di dimostrare tale sicurezza. I lavori dei ricercatori svizzeri (Bachmann e Spahr, 1995;  Spahr e Schafroth, 2001) hanno contribuito ad aprire la strada alla libera circolazione dei formaggi svizzeri in Oceania, mentre la commercializzazione di formaggi italiani, analoghi per modo di ottenimento e quindi per sicurezza “intrinseca”, è soggetta al regime della “quarantena”, se non accompagnata da specifica e copiosa documentazione sanitaria, redatta periodicamente.
D’altra parte come evidenziano gli studi sulle cinetiche di mortalità di Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in diversi formaggi (Spahr e Schafroth, 2001; Donaughy et al., 2004), così come precedentemente da quelle sui microrganismi oggetto del progetto SIFORTI (Maehr et al., 2001; Ramsaran et al., 1998; Bachmann e Spahr, 1995; Buazzi et al., 1992; Yousef e Marth, 1990; Goepfort et al., 1968), la mortalità o la sopravvivenza, se non la crescita, dei microrganismi, e quindi la sicurezza dei formaggi, sono strettamente dipendenti dalle tecniche produttive del formaggio, e quindi dall’esistenza di pressioni selettive più o meno importanti, e dalla durata della stagionatura.
Spesso inoltre gli studi sono stati effettuati da ricercatori di nazioni differenti da quelle di origine dei formaggi, ragion per cui le conclusioni tratte ad esempio su un formaggio Parmesan prodotto negli USA in base al quale L. monocytogenes aggiunta al latte può sopravvivere fino alla 16° settimana di stagionatura (Yousef e Marth, 1990) non concordano con le evidenze riscontrate sul Parmigiano-Reggiano DOP in cui il patogeno non sopravvive oltre le prime 24 ore (Panari et al., 2004). Oltre che dai protocolli sperimentali probabilmente differenti di addizione del microrganismo al latte quello che risulta sicuramente differente è la tecnica di caseificazione: i ricercatori USA per produrre il loro Parmesan hanno usato ad esempio solo 81 kg di latte pastorizzato, uno starter composto da Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus , aggiunto lipasi e cotto la cagliata a 51°C. Per ottenere una forma di Parmigiano-Reggiano o di Grana Padano DOP servono circa 500 kg di latte, si usa un sieroinnesto naturale, non si usa lipasi e si cuoce la cagliata ad almeno 53°C. La differente massa del formaggio ottenuto, oltre alle altre differenze indicate, determina cinetiche di dissipazione del calore totalmente diverse e con essa cinetiche di crescita dei batteri lattici  molto differenti (Neviani et al., 1998; Pellegrino et al., 1997) che possono spiegare anche il differente comportamento dei batteri patogeni.
Nell’immaginario collettivo e soprattutto nelle azioni delle Autorità sanitarie tuttavia è spesso fatta l’equivalenza tra “Parmesan cheese” e Parmigiano-Reggiano o Grana Padano e quindi, in assenza di informazione precisa sui formaggi “originali” le conclusioni sono inevitabilmente tratte sulla base delle “copie”, indipendentemente dalla rappresentatività della “copia”.
La completa sicurezza di un alimento non risiede inoltre solamente nell’assenza di batteri patogeni, ma anche nell’assenza di tossine prodotte dai medesimi, qualora batteri tossinogeni fossero risultati presenti in qualche fase della vita del prodotto prima della loro morte.
Fra le tossine batteriche che potrebbero essere potenzialmente presenti nei formaggi, la probabilità relativamente più elevata, anche se scarsa nella pratica documentata, è quella di ritrovare enterotossine stafilococciche e/o da E. coli, in particolare le prime a causa della maggior tolleranza della presenza di S. aureus nel latte ed inoltre per la loro termostabilità e resistenza alla proteolisi (Le Loir et al., 2003).
I metodi in uso per il rilevamento di queste tossine sono numerosi e sono basati in gran parte su metodi immunologici, di tipo ELISA, EIA o RPLA consigliati e/o validati da AOAC o, in Francia, da AFNOR. Sono inoltre utilizzati anche altri metodi basati sulla cromatografia di affinità,  sul Western Blotting o tecniche di separazione immunomagnetica (Lamprell, 2003; Pimbley e Patel, 1998).
I limiti di sensibilità dei metodi immunochimici sono generalmente compresi tra 1 e 2 ng di tossina/g di alimento. A questi metodi è riconosciuta generalmente  una buona specificità, anche se è stata riconosciuta talvolta la presenza di agglutinazioni non specifiche (Lamprell, 2003; Park et at., 1994).

La linea di ricerca SIFORTI, proprio quindi per fornire informazioni originali ed aggiornate relativamente alle pratiche casearie oggi in uso, si è posta l’obiettivo di dimostrare  in vitro ed in vivo che le pratiche produttive normalmente in uso  per l’ottenimento dei formaggi Grana Padano e Pecorino Romano, codificate anche dai disciplinari di produzione ed oggetto della tutela europea data dalla Denominazione di Origine Protetta (DOP) ai sensi del Regolamento CE 2081/92, ne assicurano la sicurezza.
Per dimostrare questo sono stati seguiti due percorsi principali:
La combinazione di ricerche eseguite sia in vitro che in vivo   è stata  prevista per poter estendere i risultati anche ad altri formaggi aventi caratteristiche di processo e prodotto analoghe.
Questa dimostrazione, come detto,  è necessaria  al fine di realizzare la libera circolazione dei formaggi italiani a lunga stagionatura ottenuti con latte crudo o comunque non pastorizzato sui mercati internazionali.
SIFORTI vuole fornire un adeguato supporto tecnico-scientifico alle affermazioni, indiscusse in Italia ed anche in buona parte d’Europa, che rivendicano la sicurezza intrinseca di questi formaggi proprio sulla base di specifiche fasi produttive.


2- Obiettivi scientifici previsti e raggiunti

Gli obiettivi generali di SIFORTI, conformemente a quanto detto in introduzione,  possono quindi  essere raggruppati in 4 gruppi:


Caratterizzazione microbiologica e chimico-fisica di Grana Padano e Pecorino Romano commerciali maturi
La ricerca di Salmonella  spp., Listeria monocytogenes , Staphylococcus aureus enterotossinogeno, Escherichia coli O157:H7 in oltre 200 campioni di Grana Padano ed in 100 campioni di Pecorino Romano, prodotti secondo i rispettivi disciplinari di produzione e campionati dai rispettivi consorzi di tutela hanno confermato l’assenza dei citati pericoli di natura microbiologica. La ricerca di altre microflore associabili ad altri pericoli microbiologici, quali i clostridi solfito riduttori nel Grana Padano e  Bacillus cereus nel Pecorino Romano, ricerca non prevista dal Progetto ma effettuata vista la disponibilità di un grande numero di campioni, ha confermato l’assenza anche di questi pericoli.
E’ stata inoltre determinata, con metodi immunologici convenzionali, l’assenza di enterotossina stafilococcica in tutti i campioni analizzati.
Le analisi chimico-fisiche hanno confermato la rispondenza dei prodotti ai requisiti normalmente associati a Grana Padano e Pecorino Romano. L’analisi stratigrafica dell’attività fosfatasica ha confermato inoltre che il Grana Padano è stato prodotto con latte crudo ed il Pecorino Romano con latte termizzato.


Messa a punto o ottimizzazione di metodi di analisi dedicati all’ottenimento dei risultati previsti
La ricerca delle cellule batteriche stressate dalle condizioni del processo di caseificazione e di quelle morte è stata oggetto di messa a punto di diverse ipotesi di protocolli di analisi che hanno portato infine alla scelta di due protocolli utilizzati quindi per studiare le dinamiche di popolazione nel corso delle prove sperimentali.
Le cellule stressate dei batteri patogeni, o almeno parte di esse, sono state rese coltivabili da un protocollo di riparazione dello stress cellulare basato sulla tecnica del doppio strato, deponendo sul terreno selettivo uno strato di terreno colturale non selettivo.
La conta delle cellule totali è stata determinata ricercando nelle medesime diluizioni decimali dei campioni utilizzate per le conte in piastra la presenza delle singole specie batteriche oggetto del progetto con la tecnica della Polymerase Chain Reaction (PCR) specie specifica. Sulla base quindi della diluizione decimale in cui si è avuta amplificazione del DNA è stato stimato il numero totale delle cellule.
Il numero delle cellule morte per ciascuna specie batterica è stato quindi ipotizzato calcolando la differenza tra il numero delle cellule totali date dalla analisi PCR effettuata sulle diluizioni ed il numero delle cellule vive (vitali e stressate) ricavato dalle conte in piastra eseguite con il protocollo di riparazione.

La ricerca delle enterotossine stafilococciche, in particolare A e B (SEA, SEB),  ha portato allo sviluppo di due metodi differenti. Le due metodiche, partendo da un punto comune identificabile nella separazione delle caseine dal latte o dalla sospensione di formaggio per addizione di acido acetico/acetato e  nell’identificazione della presenza di tossina nella frazione sierosa, hanno quindi seguito percorsi specifici.
Il primo ha concentrato la frazione sierosa per ultrafiltrazione e quindi, dopo ulteriore concentrazione della tossina per reazione con anticorpi specifici bloccati su particelle magnetiche (dynabeads) ha proceduto al riconoscimento di SEA e SEB con spettrometria di massa MALDI: la sensibilità di riconoscimento è stata di 2,8 ng tossina /g di campione.
I risultati del metodo “dynabeads-MALDI” sono quindi stati  confrontati con  quelli derivanti dall’uso del metodo di agglutinazione antigene-anticorpo passiva inversa su lattice con il kit commerciale (SET- RPLA).
Il secondo metodo invece ha previsto la concentrazione della sola SEB  dalla frazione sierosa mediante precipitazione con acido tricloroacetico al 3% ed ha sottoposto il precipitato a cromatografia di affinità su colonna in cui era legato l’anticorpo specifico per SEB: l’eluato di lavaggio della colonna di affinità (IAC), dopo concentrazione per ultrafiltrazione, è stato quindi analizzato per HPLC ed i picchi corrispondenti ai tempi di ritenzione della SEB standard sono stati raccolti e analizzati con spettrometria di massa mediante analisi tandem ESI/MS. Il limite di sensibilità della metodica è stato di 20 ng/g di campione.
I risultati del metodo “IAC-ESI/MS” sono stati parzialmente confrontati con quelli derivanti da prove preliminari con metodi di immunoprecipitazione accoppiata ad elettroforesi alcalina in presenza di SDS seguita da Western Blotting.
E’ stato inoltre messo a punto, sempre con tecnica IAC accoppiata a spettrometria ESI-MS, un metodo per la ricerca ed il dosaggio di Verocitotossina 1 prodotta da E. coli O157:H7 in latte e formaggio. Il limite di sensibilità del metodo è stato di 0,1 ppm. Il metodo non è stato confrontato con quello RPLA in quanto il sistema RPLA, in questo caso, è applicabile, secondo le indicazioni della ditta produttrice, solamente alle brodocolture.


Studio in vitro delle cinetiche di crescita, mortalità e stress di
Salmonella  spp., Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus enterotossinogeno, Escherichia coli O157:H7 durante le varie fasi della produzione di questi formaggi, compreso l’affioramento della crema,
e verifica dell’influenza del latte crudo fresco sulla capacità di contenere la crescita dei patogeni nel latte

Il periodo di stoccaggio del latte e l'affioramento della crema durante la sosta del latte in bacinella precedente la lavorazione del latte per la sua trasformazione in Grana Padano sono fasi in cui le dinamiche di crescita della popolazione microbica sono soggette ad effetti contrastanti, quali quello rappresentato dalla possibilità di crescita in funzione della temperatura e del tempo a disposizione, e quello rappresentato dall'agglutinazione dei microrganismi alla membrana dei globuli di grasso (debatterizzazione del latte parzialmente scremato – contaminazione della crema).
I risultati ottenuti hanno evidenziato che i batteri patogeni, quando aggiunti a latte crudo magro poi mantenuto nelle condizioni estreme di temperatura previste dal regolamento di produzione del Grana Padano per l'affioramento della crema (8°-20°C),  non crescono a 8°C e solo limitatamente a 20°C dopo una permanenza di 16 ore: in particolare per gli enterobatteri (Salmonella  spp. e E. coli O157:H7) si è avuta la crescita relativamente maggiore. 
Nel caso di contaminazione di latte crudo intero lasciato per 16 ore ad affiorare naturalmente, la crescita dei ceppi patogeni nel latte parzialmente scremato si è avuta solo a temperature ≥ a 20°C. In particolari condizioni di abuso di temperatura rispetto alle pratiche produttive del Grana Padano (tra 20° e 25°C), l'incremento di carica dei patogeni nel latte parzialmente scremato rispetto al livello di contaminazione iniziale del latte intero (circa 104 ufc/ml) è stato di 1-2 ordini di grandezza.  Nella crema, anche per effetto di concentrazione, le cariche sono risultate ancora più elevate raggiungendo valori ≥ a 107 ufc/ml. E’ da sottolineare che per S. aureus, con una contaminazione iniziale di circa 104 ufc/ml nel latte prima dell’affioramento, quindi superiore al limite massimo di 2x103 ufc/ml ammesso come valore di M dal DPR 54/1997 per il latte crudo, la crescita e la concentrazione nella crema anche oltre 107 ufc/ml hanno portato alla formazione di enterotossine stafilococciche  A, B e C. Questo fattore, considerando la termostabilità delle tossine, deve essere considerato per le sue possibili ricadute nella produzione del burro. La produzione di enterotossina nel latte parzialmente scremato non è stata rilevata usando il kit commerciale basato sul metodo di agglutinazione inversa SET- RPLA.
Il periodo di stoccaggio non refrigerato del latte alla stalla, aggiunto a quello di sosta del latte nelle bacinelle per consentire l'affioramento del grasso,  potrebbe quindi rappresentare anche un fattore di potenziale rischio igienico, ma solo qualora accadessero abusi di temperatura oltre i 20°C per tutta la durata dell'affioramento. In queste condizioni di temperatura più elevata, favorevoli quindi alla crescita dei batteri patogeni eventualmente presenti, deve tuttavia essere considerato anche un effetto “protettivo” maggiore dato dal concomitante sviluppo della microflora naturale del latte crudo che può limitare la crescita dei patogeni.
La produzione del Grana Padano e del Pecorino Romano prevede trattamenti di cottura della cagliata a temperature comprese rispettivamente tra 53 e 56°C e 45 e 48°C.
Per verificare l’effetto di differenti coppie tempo-temperatura (44°-56°C da 30 a 300 min) sulla sopravvivenza dei batteri patogeni sono stati sviluppati sistemi modello in cui i batteri sono stati posti in substrati con differente composizione (latte, caseinato + lattosio, cagliata) in presenza o meno di batteri lattici acidificanti.
I risultati di questa parte della ricerca hanno evidenziato che le diverse temperature di cottura della cagliata condizionano la sopravvivenza di microrganismi patogeni che potrebbero aver contaminato il latte crudo. Tuttavia, nonostante la cottura della cagliata ad elevata  temperatura svolga un ruolo fondamentale nel limitare la sopravvivenza, il solo calore fornito durante la cottura non sarebbe sufficiente per garantire la sicurezza del Pecorino Romano, la cui cagliata è cotta a max 48°C o quella della totalità della forma del Grana Padano. Infatti confidando solo nel calore, per ridurre di 5 log il numero dei patogeni occorrerebbe usare temperature di cottura particolarmente elevate (come i 56°C, raggiunti per produzioni come il Grana) e mantenerle per almeno 3 ore. Soste più brevi alla temperatura indicata o temperature di cottura uguali o inferiori   a 52°C non sono infatti risultate di per sé sufficienti ad eliminare completamente le elevate cariche di patogeni aggiunti e quindi ad essere considerate garanzia di sicurezza, anche se sono comunque punti di riduzione o quantomeno di controllo del rischio. Nonostante la cottura della cagliata del Grana sia realizzata a 53-56°C, le parti più esterne della forma del Grana Padano, una volta estratta dal siero,  infatti  si raffreddano rapidamente e la temperatura scende sotto i 52°C ben prima che siano trascorse le 3 ore indicate. La velocità di raffreddamento dipende a sua volta dalla definizione di “parti più esterne”: se si considera la superficie questa avrà una velocità di raffreddamento molto più rapida rispetto a quella di uno strato superficiale considerato avere una profondità di 2-3 cm. I dati di sopravvivenza dei batteri patogeni riferiti a modelli che vogliono considerare una “stratigrafia” della forma sono quindi inevitabilmente influenzati dalla scelta di cosa si intende per parte esterna. In ogni caso, se non intervenissero altri fattori a sommarsi al calore, come per altro intervengono, la zona esterna del Grana Padano, così come tutta la forma del Pecorino Romano, potrebbe essere a rischio.
Gli altri fattori sono in prima istanza la rapida acidificazione della cagliata che potenzia l’efficienza di riduzione della carica microbica dovuta al trattamento termico di cottura della cagliata. La sinergia tra calore e diminuzione di pH, verificata ripetendo le stesse prove di mantenimento della cagliata a temperature differenziate per tempi diversi in presenza di colture di batteri lattici termofili acidificanti, ha determinato quindi un significativo abbattimento dei patogeni non solo a 56°C, ma anche a 52°C ed una loro parziale riduzione  a 48°C, riduzione non rilevata quando i medesimi patogeni erano stati sottoposti al solo effetto della temperatura. Infine, anche se non è stata osservata riduzione di carica, in presenza di acidificazione del mezzo, è stata  tuttavia dimostrata un’inibizione dello sviluppo anche a 44°C, temperatura altrimenti favorevole alla crescita degli enterobatteri.


Studio in vivo delle cinetiche di crescita, mortalità e stress batterico durante la caseificazione e la stagionatura di Grana Padano e Pecorino Romano ottenuti con latte inoculato in caldaia con dosi elevate (> 106 ufc/ml) di Salmonella  spp., Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus enterotossinogeno, Escherichia coli O157:H7.

Il caso del Grana Padano
Sono state realizzate 15 caseificazioni a Grana Padano DOP  con addizione di Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus enterotossinogeno, Escherichia coli O157:H7 al latte in caldaia e 4 lavorazioni controllo. Le cellule sono state separate per centrifugazione dal brodo colturale e, dopo lavaggio con soluzione fisiologica e risospensione nella medesima, sono state aggiunte al latte in numero superiore a 106 ufc/ml.
Nessuno dei patogeni testati è risultato in grado di sopravvivere durante le fasi della produzione di Grana Padano DOP. E’ stata osservata solo una lievissima crescita, valutabile al massimo in 2-3 duplicazioni nel caso di L. monocytogenes o di S. aureus, durante il periodo necessario per le fasi di riscaldamento e coagulazione del latte,  periodo durante il quale le cellule non sono sottoposte a stress. Questa lieve crescita per altro è testimone della vitalità delle colture dei patogeni e quindi della positività dei risultati.
I formaggi Grana Padano oggetto della sperimentazione sono stati ottenuti secondo le prescrizioni del disciplinare produttivo, usando una tecnologia con cottura della cagliata a 53°C, quindi inferiore al valore massimo di 56°C utilizzabile per la cottura, ma coerente con la stagione estiva in cui sono state realizzate le prove che, causa la maggior temperatura ambientale, riduce la velocità di dissipazione del calore dalla forma e quindi il suo raffreddamento. In tal modo il carico termico cui sono state sottoposte le forme con i patogeni può essere considerato coerente con i valori medi di caseificazione.
Già prima della salatura, quindi dopo sole 24 ore dall’inoculo, non è più stata trovata traccia di alcuno dei patogeni aggiunti, che non sono risultati in grado di essere coltivati nemmeno usando le tecniche classiche dell’arricchimento selettivo.
La conformità dei Grana Padano sperimentali ai requisiti di prodotto caratteristici è stata verificata mediante analisi dei parametri compositivi del formaggio (residuo secco, NaCl, Aw , zuccheri residui, acido lattico e pH) ritenuti importanti per descrivere la correttezza della caseificazione e della fermentazione: i risultati di tali controlli hanno accertato l’assenza di zuccheri dopo 24 h dalla produzione, e corretti livelli di residuo secco, NaCl ed acido lattico nel prodotto.
L’assenza quindi di batteri patogeni non sporigeni anche nei formaggi sperimentali  conferma e rafforza quanto già osservato nel primo anno della ricerca allorché i medesimi patogeni erano stati ricercati, e non trovati, in oltre 200 campioni di Grana Padano prelevati dal commercio: è stato quindi dissolto il dubbio che il risultato negativo di allora potesse essere stato tale solo perchè il latte utilizzato per produrre quei formaggi poteva non essere stato contaminato da patogeni, come per altro normalmente accade.
La ricerca di enterotossine stafilococciche nei formaggi sperimentali è risultata negativa sia usando metodi immunologici con il sistema RPLA sia il metodo innovativo che ha accoppiato l’uso di particelle magnetiche con anticorpo specifico per SEB al riconoscimento della enterotossina con spettrometria di massa MALDI. Un dato contrastante è invece stato ottenuto con l’applicazione dell’altro metodo di ricerca della SEB, basato sulla cromatografia di affinità (IAC) e riconoscimento della tossina per spettrometria di massa ESI-MS. Tale ricerca avrebbe infatti identificato la presenza di SEB in quantità di 0,1-0,2 ppm già nel latte in caldaia, quantità destinata a diminuire (<0,02-0,08 ppm) nel corso della stagionatura del formaggio. Il dato, considerata la natura di proteina esocellulare delle enterotossine stafilococciche  ed il fatto che essendo state addizionate al latte cellule lavate e non le brodocolture, porterebbe ad escludere un trascinamento significativo di tossina preformata e richiede quindi conferme in quanto rischia di apparire come un “falso positivo”. I dati relativi alla dinamiche di crescita di S. aureus aggiunto al latte nelle caseificazioni a Grana Padano hanno infatti evidenziato solo una minima crescita (da 3x106 a 1x107 ufc/ml) nel periodo tra l’addizione delle cellule al latte e l’inizio della cottura. Il periodo in cui è descritta la massima produzione di SEB è quello compreso tra la fine della fase logaritmica di crescita e l’inizio della fase stazionaria (Lamprell, 2003; Le Loir et al., 2003): anche ipotizzando che la coltura al momento dell’addizione al latte  fosse  in questa fase della crescita, il tempo a disposizione prima dell’intervento del calore  (< 40 min) appare troppo breve per consentire una produzione significativa di SEB, quale quella misurata. In formaggio Montasio, sperimentalmente inoculato con S. aureus ed in cui è stata verificata la crescita fino a valori di 107 ufc/g  durante la stagionatura non era stata ritrovata enterotossina A (Stecchini et al., 1991).  I dati presentati, nell’ordine di 20-200 ng/g, risultano difformi per eccesso dai dati relativi alla possibile presenza di enterotossine stafilococciche in formaggi sperimentalmente inoculati con 106 ufc S. aureus/ml, dove era stata rilevata la presenza di enterotossine, ma a livelli compresi tra 3,2 ed 1,0 ng/g di formaggio (Meyrand et al., 1998). I dati presentati si avvicinano invece come ordine di grandezza a quelli riportati da Todd et al. (1981) che hanno ricercato SEB in formaggi tipo svizzero, prodotti in USA, il cui consumo aveva portato a casi di intossicazione. L’analisi dei campioni positivi aveva portato infatti alla quantificazione della presenza di SEB in misura variabile tra 0,15 e 7,98 _g/100 g formaggio, ovvero  tra 1,50 e 79,8 ng/g.
La ricerca di SEB in 20 campioni commerciali di Grana Padano con l’uso della tecnica IAC accoppiata a spettrometria ESI-MS ha comunque sempre dato esito negativo.
Sempre con tecnica IAC accoppiata a spettrometria ESI-MS è stata ricercata nei campioni sperimentali di cagliata e di formaggio Grana Padano in stagionatura la Verocitotossina 1 prodotta da E. coli O157:H7 e non è stata ritrovata. 


Il caso del Pecorino Romano
Il Pecorino Romano, a differenza del Grana Padano che è ottenuto esclusivamente da latte crudo, può essere prodotto sia usando latte termizzato che latte crudo, anche se questa seconda pratica è in disuso: sono state tuttavia verificate entrambe le ipotesi produttive, sia usando colture pure delle quattro singole specie batteriche per ogni caseificazione, sia  usando le 4 colture in associazione.
Salmonella  spp., Listeria monocytogenes ed Escherichia coli O157:H7, presenti nel latte in caldaia in numero superiore a 106 ufc/ml per addizione volontaria a fini sperimentali, non sono stati in grado di sopravvivere durante le fasi della produzione di Pecorino Romano DOP ottenuto da latte crudo. Durante e limitatamente alle fasi di lavorazione in caldaia, ove  la cottura della cagliata è stata realizzata a 45°C, si è avuta tuttavia talvolta sopravvivenza o crescita  dei batteri patogeni inoculati nel latte.
L’assenza di patogeni coltivabili nelle condizioni colturali standard e di patogeni “stressati”, verificata anche con le tecniche di riparazione delle cellule stressate messe a punto per il progetto,  è stata dimostrata già al termine della fase di salatura, e quindi ben prima della completa maturazione del formaggio, e conferma la capacità intrinseca al processo tradizionale di ottenimento del Pecorino Romano di creare condizioni predisponenti la mortalità dei batteri patogeni.
Il comportamento di S. aureus rispetto agli altri 3 patogeni testati è stato tuttavia diverso e quindi da segnalare: mentre infatti nei formaggi prodotti con inoculo di L. monocytogenes o enterobatteri dopo 90 o 150 giorni di stagionatura non solo le conte hanno mostrato assenza, ma anche l’analisi PCR non ha fornito più amplificazione del DNA batterico, suggerendone quindi la progressiva denaturazione, nel caso dei Pecorino Romano a latte crudo ottenuti inoculando S. aureus, a fianco delle cellule vive e vitali o comunque stressate coltivabili (103 ufc/g), l’analisi PCR ha continuato a riconoscere DNA amplificabile, corrispondente ad una quantità di cellule totali (morte più vitali più stressate) pari a 105 ufc/g, tracciando e confermando quindi una più lunga permanenza del microrganismo nel formaggio.
I risultati delle prove di caseificazione a Pecorino Romano con latte termizzato non solo hanno confermato quelli precedenti riferiti a Salmonella   spp., Listeria monocytogenes ed Escherichia coli O157:H7, ma hanno evidenziato anche la scomparsa di S. aureus. Il latte è stato inoculato con i citati patogeni, sempre a livello di 106 ufc/ml, e dopo essere stato sottoposto a termizzazione a 65°C, seguendo la pratica comune alle produzioni odierne di Pecorino Romano, ha manifestato  una immediata riduzione di carica di circa 3 log, uniforme per tutte le 4 specie, cui è seguita la scomparsa delle forme vitali già dopo 24 ore dalla produzione: eccezione, questa volta  molto parziale, è stata ancora rappresentata da S. aureus che dopo 24 ore ha presentato una carica residua di 10-20 ufc/g, carica non più ritrovata dopo 90 giorni di stagionatura alla fine del periodo di salatura.
Le specifiche modalità di salatura del formaggio, unitamente alla stagionatura prolungata per almeno 5 mesi ed alla termizzazione del latte, sono gli elementi che contribuiscono insieme a determinare la sicurezza del Pecorino Romano, anche qualora batteri patogeni risultassero presenti in numero elevato nel latte.
Le condizioni sperimentali adottate hanno portato ad ottenere concentrazioni di NaCl nella norma degli standard produttivi, se non leggermente inferiori: questo fattore, unitamente al fatto che è stata scelta la temperatura di cottura di 45°C e condizioni blande di termizzazione (65°C) rispetto alle condizioni massime previste dal disciplinare (48°C e 68°C rispettivamente), rende ancor più significativo il dato sulla mortalità dei patogeni conseguente alle pratiche produttive e quindi la dimostrazione della sicurezza intrinseca del prodotto data dal processo tradizionale.   
La ricerca delle tossine stafilococciche nel Pecorino Romano ha dato risultati di fatto equivalenti a quelli prima illustrati a proposito del Grana, con la differenza che in questo caso la negatività  con il sistema SET-RPLA è stata confermata da due diversi laboratori.
La ricerca di SEB in 10 campioni commerciali di Pecorino Romano con l’uso della tecnica IAC accoppiata a spettrometria ESI-MS ha comunque sempre dato esito negativo.
Sempre con tecnica IAC accoppiata a spettrometria ESI-MS è stata ricercata nei campioni sperimentali di latte, cagliata e Pecorino Romano in stagionatura la Verocitotossina 1 prodotta da E. coli O157:H7. La tossina sarebbe stata  ritrovata in latte ed in cagliata fino a 24 ore in misura di 0,1-0,4 ppm e non più ritrovata (<0,1 ppm) nel formaggio in maturazione. Analogamente a quanto prima commentato per SEB per il Grana Padano, le modalità di esecuzione della sperimentazione (uso di cellule lavate per l’inoculo anziché di brodocolture, crescita limitata del ceppo nelle prime ore prima della sua disattivazione verificata nel campione di cagliata di 24 ore) e le quantità ritrovate di tossina richiedono la conferma del dato.


Conclusioni

I risultati ottenuti dimostrano la sicurezza alimentare di Grana Padano e Pecorino Romano DOP prodotti secondo le pratiche previste dai rispettivi disciplinari anche qualora nel latte usato per il loro ottenimento fossero presenti batteri patogeni (Salmonella  spp., Listeria monocytogenes , Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus enterotossinogeno) in numero (>106 ufc/ml) largamente superiore a quanto finora mai verificato e potenzialmente raggiungibile solo in caso di grave mancato rispetto delle condizioni di lavorazione previste dal disciplinare, e quindi condizione di per sé già sufficiente a far venir meno la marchiatura del prodotto e soprattutto intervenire i meccanismi di controllo ed autocontrollo.
Le ragioni della mortalità dei batteri patogeni non sporigeni eventualmente presenti nel latte crudo durante le fasi produttive  sono  tuttavia specifiche per ciascuna tipologia di formaggio: principalmente il ciclo termico di produzione combinato con la rapida acidificazione della cagliata  nel caso del  Grana Padano  e l’effetto combinato della semicottura della cagliata con le pratiche di salatura e stagionatura, amplificato dall’uso della termizzazione del latte, nel caso del Pecorino Romano.
La dimostrata sicurezza anche del Pecorino Romano dimostra quanto sia necessario comprendere l’insieme dei fattori specifici di ogni produzione casearia e quanto possa essere limitante usare solo i criteri prudenziali stabiliti da FSANZ.
SIFORTI ha presentato un punto molto controverso rispetto alla possibile presenza di enterotossine stafilococciche e di verocitotossina 1 da E.coli O157:H7 nei campioni sperimentali. Mentre il metodo innovativo di concentrazione della tossina per reazione con anticorpi specifici bloccati su particelle magnetiche accoppiato al riconoscimento con spettrometria di massa MALDI  ha confermato i dati negativi derivanti dall’uso del diffuso e convalidato sistema RPLA, l’uso di un secondo metodo innovativo che ha accoppiato cromatografia di affinità e spettrometria ESI-MS ha indicato presenza di tossine batteriche nei campioni sperimentali.  I dati a sostegno della presenza di tossine in quantità ben superiori ai limiti di rilevabilità dei metodi immunologici, che come detto hanno dato invece esito negativo, richiedono innanzitutto una conferma analitica inequivoca. L’evidenziazione di tossine durante l’ottenimento di  Grana Padano e Pecorino Romano sperimentali con inoculo di batteri tossinogeni, in ogni caso dice che tale presenza non è correlabile ad una formazione di tossine durante la produzione del formaggio, in quanto essa è risultata massima già nel latte inoculato con i patogeni: la quantità di tossina quindi è diminuita nel formaggio, già a partire dalla formazione della cagliata, fino a non essere più rilevabile. Questo ritrovamento di tossina nei campioni sperimentali, qualora dimostrato, avrebbe quindi il significato di confermare quanto già affermato dalla letteratura e dalle normative sanitarie in atto: è fondamentale e necessario controllare la “storia” del latte (temperature e tempi di stoccaggio) dal momento della sua produzione alla trasformazione, perchè qualora S. aureus in seguito ad una forte contaminazione crescesse oltre 106 ufc/ml potrebbe produrre enterotossine e queste, grazie alla loro termostabilità, potrebbero essere veicolate nel formaggio.
Si deve ribadire inoltre che la metodica IAC accoppiata a spettrometria ESI-MS che ha rilevato tossine batteriche nei campioni sperimentali, non ha rilevato tossine nei campioni commerciali.
Le ragioni della sicurezza di Grana Padano e Pecorino Romano sono quindi il risultato ottimale della sommatoria di una serie di pratiche tradizionali, tutelate e controllate dal sistema della DOP, eseguite non tanto al fine di garantire la sicurezza del formaggio e quindi come tali potenzialmente interpretabili come un obbligo evadibile perchè inutile o dannoso per la qualità del formaggio, ma finalizzate proprio a garantire la qualità dei formaggi.
Si ribalta  quindi nel caso dei formaggi a pasta cotta a lunga stagionatura ottenuti da latte crudo l’assioma che non ci può essere qualità senza sicurezza, perché è la ricerca della qualità attraverso il mantenimento di pratiche tradizionali che ne garantisce anche la sicurezza.


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Risultati Finali linea GEFORPASTA

1- Stato dell'arte scientifico e applicativo

Le tecnologie di conservazione del latte per essiccamento e di frazionamento nei suoi componenti hanno sviluppato una gamma di prodotti anidri (caseinati, caseine, proteine concentrate del latte, sieroproteine) con proprietà funzionali e nutrizionali che trovano largo impiego nel settore lattiero caseario ed in quello alimentare.
L’uso di tali prodotti nel settore lattiero caseario è finalizzato principalmente alla sostituzione di parte del latte liquido o alla standardizzazione della composizione del latte per ragioni tecnologiche e di identità di prodotto. L’uso di ognuno di questi prodotti anidri è regolato da specifiche normative europee e nazionali.
L’uso di caseine e caseinati è vietato in Europa dal Regolamento CE 2921/1990, in quanto la produzione di caseine e caseinati gode di un aiuto comunitario che è concesso proprio per sottrarre aliquote di latte magro dal mercato lattiero-caseario, contribuendo quindi a governarne i prezzi.
Alla fine degli anni 1990, grazie allo sviluppo dell’innovazione tecnologica, è cresciuta la disponibilità di proteine concentrate del latte (PCL) e la loro diffusione sul mercato. Tale prodotto non gode di sostegno economico comunitario e quindi in Europa non esistono limitazioni al suo impiego nel settore caseario.
L’utilizzo di PCL in Italia gode invece di una situazione normativa “contrastata”: nell’assenza di precisi indirizzi in Gazzetta Ufficiale, il Ministero delle Politiche Agricole, da cui dipende l’Ufficio per la Repressione delle Frodi,  sostiene una posizione contraria all’utilizzo di PCL , in contrasto di fatto con il Ministero della Salute, che invece le considera lecite, in quanto ammesse di fatto dal DPR 54/1997 limitatamente alla  fabbricazione dei “prodotti a base di latte”, e quindi non per la produzione di latte alimentare (Mucchetti, 2003).
Le due tecniche principalmente utilizzate per ottenere le PCL sono la coprecipitazione delle caseine con le sieroproteine e l’ultrafiltrazione (Bylund, 1995). Le PCL risultano quindi diverse sia per il metodo di produzione, sia per la composizione centesimale che nel caso del prodotto ottenuto per UF presenta un’ampia gamma di tenore in proteine (dal 40 al 90%) e quindi di lattosio. Tale variabilità è determinata dall’intensità del trattamento di diafiltrazione o di lavaggio del concentrato applicato che determina, a sua volta, la percentuale dei componenti solubili non proteici, in particolare il lattosio: l’incremento del tenore in proteine dal 75 all’80% fa scendere il contenuto di lattosio da circa 11% a 5,5%, e l’ulteriore proseguimento della diafiltrazione, mentre fa aumentare il tenore proteico anche oltre il 90%,  riduce a tracce quello del lattosio.
Il divieto comunitario all’uso di caseine e caseinati nei formaggi ha reso necessario la ricerca di metodi di analisi atti ad identificarne l’uso: il progetto di ricerca SMT Project CT 97-2208 “Determination of added casein/caseinate in cheese and processed cheeses”, concluso nel 2000, ha valutato differenti approcci analitici fra cui lo studio della variazione dei rapporti tra caseina e sieroproteine, la determinazione della presenza di k-caseina intera (e non quindi di para k-caseina), l’applicazione di tecniche NMR e lo studio di marcatori molecolari quali la lisinoalanina (LAL). LAL è sempre risultata presente in caseine e caseinati commerciali in quantità variabili legate alle tecnologie di produzione ed all’accoppiata tra pH del derivato ed intensità del trattamento termico. La determinazione di LAL è risultata, fra quelli testati, uno dei metodi più promettenti ed efficaci (Frati, 1999).
L’eventuale divieto d’uso di PCL in Italia richiederebbe quindi, a sua volta, la messa a punto di metodi di analisi atti a verificarne l’uso.
Non solo, poiché in Europa un prodotto è vietato e l’altro lecito, occorrerebbe inoltre verificare che i marcatori utilizzati siano specifici per riconoscere l’uso di caseinati o PCL.
I metodi usati per riconoscere la presenza in un formaggio di proteine essiccate sono basati principalmente sulla ricerca di marcatori molecolari indice di danno termico.
De Groot e Slump (1969) hanno dimostrato che severi trattamenti termici e/o alcalini inducono l'interazione proteina-proteina, con formazione di nuovi legami nella stessa catena proteica o in catene vicine, formando composti naturalmente assenti negli alimenti come la lisinoalanina , la lantionina e l'ornitinoalanina.
La formazione di questi nuovi aminoacidi è il prodotto di una reazione di _-eliminazione con formazione di deidroalanina. La deidroalanina, a sua volta, può reagire con NH3 per formare _-aminoalanina, con l’_-NH2 della lisina formando la LAL, con il _-NH2 della ornitina formando l'ornitinoalanina, con il gruppo imidazolico della istidina per formare l’istidinoalanina, con il gruppo SH della cisteina formando la lantionina. L’addizione di questi gruppi alla metildeidroalanina derivante dalla treonina produce analoghi composti metilati.
Gli amminoacidi solforati, metionina e cisteina, e la cistina si trasformano in deidroalanina, liberando nel mezzo solfuri. Quando le condizioni del trattamento sono moderatamente alcaline la cistina rappresenta il precursore preferenziale della Dha, mentre all’aumentare del pH cresce l’importanza della serina nella sua formazione.
Per addizione di ammine e tioli si formano, quindi, ramificazioni intra- e inter-catena (Dalgleish, & Hunt, 1995, Freimuth, et al., 1974) con la formazione di strutture tridimensionali rigide non digeribili dagli enzimi intestinali (Singh, & Latham, 1993).
La formazione di tali aminoacidi avviene anche nelle polveri ottenute per co-precipitazione od ultrafiltrazione, così come in composti di invecchiamento delle proteine che riducono digeribilità e  qualità nutrizionale delle proteine alimentari (Friedman, 1996).
Oltre a queste modificazioni, in presenza di lattosio e calore, si possono avere fenomeni di glicosilazione delle proteine. Marvin et al. (2002) e Scaloni et al. (2002) utilizzando la spettrometria di massa ESI e MALDI hanno identificato vari siti di glicosilazione delle proteine del latte a seguito di trattamenti termici. Ad esempio, la Lys-34 dell’_s1-CN e la Lys-107 della _-CN sono stati identificati come gli amminoacidi più esposti a tale glicosilazione a seguito di blandi trattamenti termici, mentre molti altri residui di lisina risultano coinvolti quando sono applicati trattamenti più severi. Si osserva, inoltre, la formazione di aggregati macromolecolari, con cambiamenti nella struttura secondaria, accumulo di carbonili sulla caseina e degradazione e trasformazione degli zuccheri legati alle proteine del latte (French et al., 2002, Kleyn and  Klostermeyer, 1980, Leclerc e Calmettes, 1997, Pellegrino et al.., 1999, Siciliano et al.,2000).
La furosina, amminoacido glicosilato usato come marcatore del trattamento termico del latte a temperatura elevata e come marcatore dell’impiego di latte in polvere nella produzione di paste filate fresche italiane (Resmini et al. 1990), può quindi risultare un marcatore poco utile nel caso di eliminazione di lattosio prima della essiccazione, come avviene nel caso della produzione di caseine e caseinati, mentre potrebbe risultare utile per identificare la presenza di proteine lattosilate in formaggi ottenuti con addizione di prodotti commerciali derivati dall’essiccamento di concentrati proteici in cui è ancora presente una buona quantità di lattosio.  
La diversa percentuale di lattosio, durante il processo produttivo dei derivati anidri del latte, a causa degli inevitabili trattamenti termici legati alla fase di essiccamento, fa sì infatti che si possano formare in modo prioritario prodotti della reazione di Maillard (1912) che saranno determinati come furosina oppure alcune nuove molecole dovute a reazioni di cross-linking tra amminoacidi, quali  ad esempio le citate lisinoalanina, istidinoalanina ed ornitoalanina.
Infine è da considerare che, per rendere realmente effettiva la possibilità di distinguere formaggi ottenuti con addizione di caseinato da quelli ottenuti con PCL, occorrerebbe avere una definizione condivisa a livello internazionale di cosa si intenda per PCL:  tale definizione, al momento mancante, assume una valenza particolare perché da essa potrà dipendere l’idoneità dei marcatori ed il considerare lecito o meno l’uso dei prodotti disponibili sul mercato.
Il recente Decreto Legislativo 181 del 23/6/2003 (GU 167 del 21/7/2003) che aggiorna la legge 109/1992 sull’etichettatura dei prodotti alimentari dice ad esempio che la designazione generica “proteine del latte” può essere usata in  sostituzione di definizioni più specifiche, quali “tutte le proteine del latte (caseine, caseinati, proteine del siero di latte) e loro miscele” e quindi continua a non fare chiarezza in questo campo.
I requisiti di composizione di caseine e caseinati indicati dal Reg CE 2921/1990 possono aiutare a definire innanzitutto cosa non sia considerabile “proteina concentrata del latte”, in quanto già considerata caseinato: l’allegato III considera caseinati anche quei derivati  che oltre ad avere un tenore in proteine totali maggiore dell’85% contengono “più del 5% e fino ad un massimo del 17% di proteine del latte diverse dalla caseina, precipitate simultaneamente e calcolate sul tenore totale di proteine del latte”.
La differenziazione tra PCL derivanti da UF e co-precipitati e quella tra co-precipitati  vendibili come PCL e caseinati dell’Allegato III, oppure ancora la possibilità di distinguere PCL ottenute direttamente da latte da miscele di caseine e sieroproteine concentrate richiede approcci analitici non solo qualitativi ma anche quantitativi sicuramente complessi.
Tale differenziazione diventa tuttavia fondamentale, se non si vuol correre il rischio di far produrre caseinati con aiuto comunitario che poi possono essere venduti come PCL a causa della mancanza di possibilità di controlli efficaci e di metodi ufficiali che supportino le analisi di revisione in caso di contenzioso (Mucchetti, 2003).
Più semplice appare il caso dei formaggi DOP ove qualsiasi addizione di derivati anidri, anche a fini di standardizzazione, non è ammessa sia perché non prevista dal disciplinare sia perché, non esistendo  in Italia stabilimenti di produzione di PCL, il latte usato come materia prima non deriverebbe dal territorio di produzione del formaggio.
In questo contesto GEFORPASTA si è posta lo scopo di ottimizzare o mettere a punto nuovi metodi in grado di permettere di verificare l’addizione di proteine essiccate del latte (caseine, caseinati e proteine concentrate del latte) ai formaggi: in particolare si è scelto di testare i formaggi a pasta filata, e nello specifico  Mozzarella e Caciocavallo Silano DOP, perché tali formaggi per la loro specifica tecnologia meglio si prestano rispetto ad altri per l’inclusione nel prodotto di proteine essiccate. Non solo, poiché i marcatori più probabili sono da individuare tra le molecole derivanti dal trattamento termico di essiccazione, le paste filate meglio si prestano rispetto ad altri  per testare la validità dei marcatori perché la loro produzione prevede una fase supplementare di filatura a temperatura compresa tra 58 e 70°C che può favorire la formazione di molecole indice di danno termico.


2- Obiettivi scientifici previsti e raggiunti

La linea di ricerca GEFORPASTA ha avuto l’obiettivo di cercare di dimostrare l’avvenuta addizione di proteine essiccate del latte (caseine, caseinati e proteine concentrate del latte) ai formaggi a pasta filata.
La complessa situazione del mercato dei prodotti anidri dei derivati del latte complica profondamente il lavoro di ricerca volto ad identificare analiti marcatori, anche perché, come detto, manca una definizione condivisa a livello internazionale di PCL.
Il primo obiettivo di GEFORPASTA è stato quindi la semplificazione e l’ottimizzazione del metodo di dosaggio di LAL  con la tecnica HPLC a rilevazione fluorimetrica ed il confronto tra laboratori sull’applicabilità del metodo per verificarne la sensibilità e la riproducibilità.
A questo obiettivo sono stati affiancati lo studio di metodi alternativi di determinazione di LAL, e la ricerca di altre molecole marcatrici (note quali la furosina, o da individuare sulla base dello studio delle caratteristiche di differenti polveri proteiche) che possano integrare/confermare il significato della rilevazione dell’eventuale presenza di LAL nel formaggio o sostituirsi alla LAL, quando il processo di produzione del derivato proteico essiccato sia stato condotto in condizioni tali da non esaltare la formazione di LAL , come nel caso della produzione della caseina acida.
A questi obiettivi di natura “analitica” si è affiancato lo studio dell’effetto dell’addizione di proteine essiccate sulla resa di caseificazione, allo scopo di dimostrare le motivazioni (tecnologiche e/o commerciali) che possono essere alla base del loro utilizzo.


Semplificazione ed ottimizzazione del metodo di dosaggio di LAL  con la tecnica HPLC
Il metodo definitivo di analisi della presenza di LAL in campioni di formaggio mediante HPLC è stato il risultato di una serie di modificazioni della metodica rispetto a quella originalmente proposta da Pellegrino et al (1996). Tale metodo modificato è stato valutato sia analizzando campioni di Mozzarella e Caciocavallo Silano appositamente prodotti nel corso del progetto ottenuti con addizioni differenti e note di caseina acida, caseina presamica, caseinato di calcio e PCL sia attraverso analisi circolari effettuate su campioni commerciali di paste filate prelevate dal commercio e su campioni prodotti nel corso del progetto, ma di cui era ignota agli analisti l’addizione o meno di proteine essiccate.
Il metodo ha riconosciuto in modo quantitativo l’addizione anche di minime quantità di proteine essiccate. La sensibilità di dosaggio di LAL è stata tale da riconoscere l’addizione di 0,06 kg di polvere di caseinato di calcio (avente un contenuto di circa 100 ppm di LAL sulla proteina) a 100 kg di latte, equivalente a circa 2 ppm/100 g proteina (Tabella 1).
L’analisi dei formaggi controllo (Mozzarelle e Caciocavallo Silano), ottenuti da latte sicuramente esente da polveri proteiche aggiunte, ha confermato l’assenza di LAL:  questo significa che nelle normali condizioni di produzione di queste due tipologie di formaggio, caratterizzate dall’uso di latte crudo o pastorizzato una sola volta, dall’assenza di impiego di innesti o dall’uso di sieroinnesto naturale e dalla filatura della cagliata, non si ha formazione di LAL.
Questa conclusione non significa tuttavia che in tutti i formaggi  debba essere assente LAL e non può quindi essere generalizzata: nel corso del progetto ad esempio non sono stati analizzati formaggi ottenuti mediante l’impiego di lattofermenti ottenuti con terreni colturali a base di derivati anidri del latte che potrebbero contenere anche LAL tra le molecole marcatrici di danno termico.
Non è possibile tuttavia eseguire una rappresentazione grafica unica dei dati che metta in relazione la presenza di LAL con la quantità di proteina essiccata aggiunta, in quanto le singole polveri  commerciali usate per la sperimentazione, hanno presentato grandi diversità nel loro contenuto in LAL (da 60 a 800 ppm sulla proteina). Questa è inoltre la ragione, per altro già nota, per cui non è possibile quantificare la proteina aggiunta a partire dal dato di LAL, a meno che non si conosca anche la proteina aggiunta (tipo, lotto etc).
I risultati dell’analisi circolare dei campioni a titolo noto di polvere aggiunta eseguita da 4 laboratori differenti hanno tuttavia evidenziato una forte variabilità nei valori assoluti, soprattutto nel caso dei campioni di Caciocavallo Silano ottenuti con caseinato (Tabella 1).

 

Questa variabilità può essere meno importante se sarà considerata indice di frode la sola dimostrazione qualitativa della presenza di LAL: qualora il legislatore pensasse di fissare un valore soglia di LAL diverso da zero, i possibili effetti della variabilità   dovranno essere considerati più a fondo.
Per verificare la riproducibilità del metodo quando chiamato a riconoscere campioni “ignoti” sono stati   organizzati due test circolari. Nel primo sono stati inviati 9 campioni prodotti sperimentalmente nel corso del progetto scelti fra quelli già analizzati, ma senza dare in questo caso all’analista informazioni circa la natura del campione: la ripetizione delle analisi non ha confermato esattamente il dato ed è stata indicata da alcuni laboratori la presenza di 1-2 ppm di LAL nei due campioni controllo ottenuti senza addizione alcuna di proteine essiccate e di cui nella tornata precedente di analisi era stata accertata l’assenza di LAL.
Per spiegare questa discordanza è stato  ipotizzato che i risultati fossero falsi positivi dovuti ad una lieve accidentale contaminazione in un punto non precisato della procedura analitica.
Il secondo test circolare ha  utilizzato 23 formaggi a pasta filata (Mozzarelle in liquido di governo, Mozzarelle per Pizza, Scamorze e preparati alimentari per Pizza o imitation cheeses) reperiti in parte (17) dal commercio ed in parte (6) prodotti nel contesto del progetto e mai analizzati precedentemente.
I risultati delle analisi dei 23 campioni incogniti hanno evidenziato una inattesa variabilità soprattutto nel discriminare la presenza o l’assenza di LAL (Tabella 2).


* I dati riferiti al laboratorio 1 bis sono dati riportati dal lab 1, ma ottenuti con un secondo HPLC e differente personale

Sui 23 campioni analizzati, 5 campioni sono stati riconosciuti LAL positivi da tutti i laboratori: solo 7 dei restanti 18 campioni sono stati concordemente valutati come negativi, mentre i restanti 11  campioni hanno presentato risultati più o meno discordi, ed in particolare 6 campioni sono stati giudicati negativi solamente da un laboratorio.
Se fosse considerata rappresentativa la campionatura dei formaggi prelevati al commercio, i dati rappresentati dalla maggioranza dei laboratori indicherebbero un uso significativo di proteine essiccate, forse anche maggiore rispetto ai dati di mercato. 
La mancanza di concordanza tra i laboratori sulla determinazione di presenza/assenza di LAL significa che talvolta, con frequenze variabili, si sono avuti risultati che possono essere considerati, a seconda dei casi, “falsi positivi” o “falsi negativi”.
Quali le possibili ragioni di questo inatteso andamento di risultati, discorde dal precedente riferito a campioni in cui era nota la presenza o meno di proteina essiccata aggiunta? Una risposta univoca non è ancora oggi possibile.


Determinazione di LAL con procedura LC-ESI/MS/SIM
Il progetto si è posto l’obiettivo di mettere a punto anche  un metodo di analisi che, grazie ad un approccio analitico diverso basato sulla spettrometria di massa, potesse essere utile per confermare il dato del metodo HPLC in caso di contestazioni e quindi essere destinato a laboratori di revisione di analisi e/o a strutture equipaggiate con idonee attrezzature di spettrometria di massa.
La procedura LC-ESI/MS/SIM può quindi essere considerata alternativa/complementare a quella HPLC con rivelazione fluorimetrica oggetto dell’obiettivo precedente.
Il metodo si è differenziato inoltre da quello HPLC per l’uso di uno standard interno (N-_-metillisina) e per il fatto che non sono previsti trattamenti preliminari del campione quali la purificazione dell’idrolizzato su colonna cromatografica C18 e la purificazione del derivato FMOC su cartuccia di gel di silice con legata una fase polare di amminopropilsilano: il riconoscimento della presenza di LAL nel campione è ottenuto usando la  spettrometria di massa  con la tecnica ESI/MS/SIM che per il derivato LAL (FMOC)3 presenta un segnale a m/z 900,4 (35,3min) corrispondente alla massa teorica della LAL(FMOC)3 (900.3Da). Prove di frammentazione hanno permesso di identificare gli ioni frammento derivanti dallo ione parente confermando che il FMOC reagisce sia con la ammine primarie che secondarie presenti nella LAL.
L’applicazione della procedura LC-ESI/MS/SIM ai 23 campioni  “ignoti” del secondo test circolare ha evidenziato come LAL negativi solo 7 dei 16 campioni identificati come negativi con il metodo HPLC da almeno 1 laboratorio (Tabella 3).




Questa discordanza tra i due metodi, se si da, come si deve dare, alla procedura LC-ESI/MS/SIM una valenza “superiore” proprio perché identifica il picco non solo sulla base del tempo di ritenzione anche del suo peso molecolare,  sembrerebbe quindi indicare che il metodo HPLC potrebbe talvolta sottostimare la presenza di LAL e fornire talvolta risultati “falsi negativi”. Si deve per altro notare che questo evento non si è verificato nelle prove con i formaggi di cui era nota o meno l’addizione di derivati proteici anidri. L’uso del condizionale è tuttavia d’obbligo perché il metodo innovativo non è stato ancora testato da altri laboratori e quindi manca di validazione.


Ricerca di altre molecole marcatrici
Se la determinazione della presenza di LAL nel formaggio, quale sia il metodo usato, è un indice di addizione di derivati proteici essiccati, essa tuttavia non può permettere di distinguere la varietà di derivato proteico usata. Nel caso inoltre di addizione di quantità limitate di caseina acida o presamica, caratterizzate da un ridotto contenuto di LAL, la sensibilità del metodo risulterebbe inferiore ai limiti prima indicati e quindi potrebbe non essere sufficiente per prevenire completamente eventuali frodi.
Per aumentare la probabilità di individuare l’addizione di derivati proteici essiccati, ed eventualmente riconoscerli, occorre quindi ricorrere anche allo studio di altri marcatori molecolari.
Uno di questi, presente nelle PCL, è la furosina. Nei formaggi sperimentali prodotti con PCL, assieme a LAL, si ritrova infatti una presenza di furosina superiore ai limiti che si hanno nei formaggi  ottenuti esclusivamente da latte liquido. L’addizione al latte di  PCL-UF in quantità variabile, proprio perché PCL contiene assieme a LAL anche furosina,  ha fatto spesso superare ai campioni i limiti di 10-12 mg furosina/100 g proteina stabiliti  dalla normativa italiana per i differenti tipi di  formaggi freschi a pasta filata. Come già motivato per LAL, a causa della variabilità del contenuto di furosina nelle PCL e nei derivati del latte essiccati, non sembra possibile stabilire una relazione precisa tra valori di furosina presente nel formaggio e quantità di proteina aggiunta. A differenza di LAL che è risultata assente nei formaggi prodotti senza addizione di proteine  essiccate, nel caso della furosina inoltre si ha l’ulteriore complicazione che il processo di produzione delle paste filate fresche sicuramente “genuine” determina la formazione di prodotti della reazione di Maillard che sono stati misurati in 6,6 mg furosina/100 g proteina.
La valutazione combinata della presenza di LAL e furosina potrebbe permettere quindi di distinguere non solo i campioni di formaggio ottenuti senza addizione di proteine essiccate dagli altri, ma anche di ipotizzare se sia stato aggiunto caseinato o PCL. 
Lo stesso risultato, almeno a livello qualitativo, è stato ottenuto attraverso la ricerca delle forme di caseina _s1 modificate dal trattamento di produzione della polvere. Usando la tecnica combinata di elettroforesi 2D accoppiata alla spettrometria di massa ESI/MS è stato possibile identificare, sia nei derivati proteici essiccati che nei formaggi ottenuti con quest’ultimi, varie forme modificate della  caseina  _s1, fra cui quella lattosilata (quindi alla base della successiva formazione di furosina) e quella modificata dalla reazione di defosforilazione alla base della formazione di deidroalanina (DHA) che reagisce con l’ _ NH2 della lisina dando quindi origine alla formazione di LAL.
E’ stato tuttavia confermato, analizzando nel corso del progetto una vasta campionatura di prodotti commerciali, che il contenuto di furosina delle PCL, ed anche dei caseinati, è molto variabile. Questa variabilità inoltre non sempre o necessariamente è legata, come ci si dovrebbe aspettare,  al tenore residuo in lattosio delle PCL.  Ad esempio è stato verificato che le PCL usate per produrre i Caciocavallo Silano sperimentali,  pur avendo un tenore proteico di 85%  hanno presentato valori di furosina di 296 mg/100 g proteina,  ben superiore di quello misurato nelle PCL usate per produrre le Mozzarelle sperimentali che pur avendo un tenore proteico del 70% hanno mostrato valori di “soli” 52 mg furosina/100 g proteina. Questa differenza di furosina nelle polveri si è tradotta quindi in un diverso contenuto di furosina (sopra o sotto il valore legale ammesso dalla normativa italiana) dei formaggi, a parità di quantità di PCL aggiunte.
Non solo, la furosina è stata ritrovata in dosi inusuali anche nel caseinato usato per ottenere il Caciocavallo Silano, e nel formaggio ottenuto con addizione di tale caseinato è stata così rilevata anche una quantità di furosina eccedente i limiti legali fissati per le Mozzarelle.
L’ipotesi quindi che il ritrovamento della sola LAL sia indice di addizione di caseinati, mentre quello contemporaneo di LAL e furosina sia indice di addizione di PCL, può essere in generale una buona indicazione, ma non sempre e necessariamente riesce a descrivere la complessità della realtà produttiva.
In Italia ad esempio la determinazione della furosina nei formaggi a pasta filata è stata prevista per escludere l’impiego di latte in polvere o di cagliate di importazione ottenute a loro volta con latte in polvere: dal punto di vista teorico l’addizione contemporanea di caseinato e latte in polvere porterebbe ad ottenere la presenza contemporanea di LAL e furosina. Questa ipotesi, non prevista dagli obiettivi di GEFORPASTA, dovrebbe essere verificata sperimentalmente: se si accettasse infatti il postulato che  la presenza contemporanea di LAL e furosina sia sinonimo di addizione di PCL (come per altro in molti casi è risultato vero), e l’ipotesi fatta risultasse concreta, si rischierebbe il  paradosso di “legalizzare” formaggi prodotti con l’addizione combinata di caseinato e latte in polvere.
Questa complessità di situazioni, anche se rischia di far apparire più “deboli” i risultati e gli avanzamenti di conoscenza ottenuti da GEFORPASTA, non può essere sottovalutata. La capacità di riconoscere e discriminare l’uso di derivati anidri del latte nel formaggio, nel momento in cui possono intervenire frodi, può avere infatti ricadute sul piano normativo e quindi devono essere attentamente valutate e quantificate le varie possibilità.  Altrettanto non può essere dimenticata la diversità della situazione italiana rispetto al resto d’Europa, soprattutto relativamente alla possibilità di uso di latte in polvere e/o PCL, ed a tal fine è importante sottolineare che i risultati attuali di GEFORPASTA, ed i loro futuri sviluppi, dovrebbero essere valutati in un’ottica europea e non solo italiana.


Ricerca di altri marcatori molecolari diversi da LAL e furosina

GEFORPASTA ha  avviato quindi una strategia di ricerca complementare o alternativa agli approcci classici, oggi agli inizi se confrontata con la ormai lunga storia di ricerche dedicate a LAL e furosina, tesa a individuare modificazioni delle proteine lattee dovute a trattamenti termici.
In estrema sintesi sono stati seguiti due indirizzi di studio.
Il primo indirizzo ha ricercato la formazione di complessi macromolecolari tra sieroproteine e caseine, tipiche delle PCL, o tra caseine. In particolare è stata valutata da un lato  la possibilità di riconoscimento con metodo ELISA degli  addotti tra ß-lattoglobulina e caseina nelle proteine concentrate del latte e dall’altro è stato confrontato il profilo cromatografico su colonna a scambio anionico della caseina presente nel prodotto commerciale “caseinato di calcio” con quello della caseina presente in latte crudo o pastorizzato. Il confronto ha evidenziato differenze importanti in quanto nel derivato essiccato sono stati identificati  copolimeri delle caseine, con peso molecolare tra 56 e 180kDa, caratterizzati da legami di tipo covalente, resistenti ad agenti riducenti. Tale presenza è stata confermata dalla analisi di mappe triptiche che hanno evidenziato la presenza di peptidi di peso molecolare più elevato assenti nella caseina nativa
Il secondo indirizzo di studio si è invece orientato sulla elaborazione di una procedura analitica originale per localizzare nella catena delle singole frazioni proteiche del latte i residui amminoacidici del tipo della deidroalanina (DHA)  e deidro-butirrina (DHB)  formati a seguito di reazione di ß -eliminazione, non ancora reagiti con gli _- N gruppi della lisina. L’identificazione dei siti innaturali di DHA e DHB nelle caseine è stata ottenuta mediante l’impiego di tecniche coordinate che hanno previsto:
Tra i peptidi contenenti DHA e DHB sono state identificate ulteriori modifiche a carico di residui di metionina, serina, asparagina e lisina, quest’ultima modificata anche da gliossale proveniente da prodotti della reazione avanzata di Maillard.
I risultati ottenuti hanno dimostrato su base molecolare in modo originale un complesso di reazioni di degradazione delle catene proteiche che avvengono a seguito di trattamento di essiccazione dei derivati del latte.
Questa strategia di ricerca sta offrendo spunti   interessanti e le basi per approfondimenti in futuri sviluppi della ricerca. Al momento potrebbe tuttavia essere troppo anticipato prevedere un possibile utilizzo applicativo delle diverse possibili molecole marcatore individuate, sia perchè deve ancora essere verificata la loro regolare presenza nei differenti derivati anidri del latte sia perché deve essere verificata l’applicabilità dei metodi di analisi da parte dei laboratori addetti ai controlli.


Effetto dell’addizione di proteine essiccate sulla caseificazione

Per poter eseguire gli studi descritti con materiale di origine “certa” e quantità note di proteina aggiunta che permettessero di “calibrare” i metodi di dosaggio di LAL  si è proceduto allo studio di condizioni idonee di produzione di formaggi a pasta filata mediante addizione di quantità differenti di caseina (acida e presamica), caseinato di calcio e PCL. Ognuno di questi prodotti anidri è caratterizzato da specifiche proprietà di dissoluzione ed idratazione e quindi le tecniche di miscelazione al latte o alla cagliata utilizzate per produrre i formaggi sperimentali sono risultate differenti.
Le motivazioni per l’uso di tali prodotti nel settore lattiero caseario sono legate a ragioni economiche per cui può essere conveniente sostituire parte del latte liquido  o a ragioni tecnologiche per cui l’addizione di proteine essiccate diventa un mezzo più facile per  standardizzare la composizione del latte rispetto all’uso dell’ultrafiltrazione del latte allo stabilimento.
Nel contesto di GEFORPASTA si è voluto  inoltre verificare l’influenza dell’addizione di derivati anidri del latte (caseina e PCL) sul processo di trasformazione del latte e sulla resa in Mozzarella. Per ridurre l’influenza di altre variabili di processo è stato scelto di produrre Mozzarella mediante la tecnologia di preacidificazione del latte con acido citrico, mantenendo costanti le condizioni di filatura.
Dopo aver verificato preliminarmente la correlazione positiva tra addizione di dosi crescenti di caseinato di calcio o di PCL UF ed incremento della resa ponderale di caseificazione, è stato scelto di approfondire lo studio dell’influenza dell’addizione di  PCL UF sulla caseificazione del latte a Mozzarella, poiché l’uso di PCL è sempre più diffuso in Europa e trova applicazioni casearie anche in Italia, nonostante i già citati divergenti pareri dei Ministeri competenti.
Lo studio analitico relativo alla composizione (grasso, proteine e residuo secco) della Mozzarella e dei fluidi di processo (latte, siero ed acqua di filatura) ha permesso di evidenziare che le PCL aggiunte al latte sono effettivamente inglobate nel formaggio, in quanto il rapporto tra la massa di proteine presenti nella Mozzarella e quella presente nel latte è risultato sostanzialmente uguale sia nel caso dei formaggi ottenuti da latte arricchito che in quello controllo. Questo dato, unito all’incremento ponderale delle quantità di formaggio ottenute, conferma quindi che l’addizione di PCL consente di aumentare la resa, e quindi, sulla base dei prezzi delle medesime rispetto a quello del latte, si determinano o meno le ragioni economiche del loro utilizzo.
Le PCL, come detto, trovano una importante ragione  di utilizzo nel contesto della standardizzazione della composizione del latte al fine di consentire un’effettiva automatizzazione del processo produttivo ed un corretto sfruttamento degli impianti produttivi. Ne è quindi stato testato l’uso anche in condizioni finalizzate principalmente alla standardizzazione del rapporto tra grasso e proteine del latte, elemento indispensabile per la standardizzazione produttiva.  Nelle prove inoltre non solo è stato standardizzato il rapporto grasso/proteina ad un valore di 1,1, ma è stato anche stabilito di fissare il contenuto proteico del latte ad un valore costante di 3,7% grazie all’addizione di quantità variabili di PCL (da 0,2 a 0,4 kg proteina/100 kg latte) ed eventuali integrazioni di crema. I risultati di queste prove hanno indicato che in questo modo non solo si è incrementata la resa di trasformazione del latte standardizzato in Mozzarella, risultata pari al 14,8±0,1% a fronte di un valore di resa del 13,2±0,4 delle prove controllo, ma si è ridotta la variabilità della medesima e con essa anche quella della composizione del prodotto.
L’addizione di PCL al latte è quindi uno strumento che, a seconda di come è gestito, può permettere di incrementare le rese produttive e /o di standardizzarle, obiettivo fondamentale per un’industria moderna in quanto la standardizzazione della resa significa anche standardizzazione della composizione del formaggio sui livelli desiderati e quindi sua maggiore identità.
Le ragioni dell’uso di PCL, e per analogia purtroppo quelle dell’uso fraudolento di caseinati, risiedono quindi in  motivazioni tecnologiche e di marketing (standardizzazione di processo e prodotto, identità) che si possono coniugare con ragioni economiche in funzione dei rispettivi prezzi di mercato di latte, crema e PCL.
La difesa degli interessi nazionali di un Paese importatore di latte, quale è l’Italia, deve considerare che in una situazione di libero mercato si può anche impedire per decreto quello che è consentito nel resto di Europa (l’uso di PCL), ma che le ragioni di tale uso non sono effimere e quindi il rischio è quello di far delocalizzare le produzioni casearie non DOP (oltre il 50% dei formaggi italiani) in quei Paesi in cui tali vincoli non esistono. 


Conclusioni

Grazie anche ai  risultati di GEFORPASTA già da oggi diventa possibile distinguere con un buon grado di attendibilità i formaggi a pasta filata (Mozzarella e Caciocavallo Silano) ottenuti da latte cui sono state addizionate anche minime quantità di proteine lattee essiccate (fino a 0,06kg di proteina essiccata/100 kg di latte) dai formaggi controllo: quest’ultimi infatti sono risultati non contenere LAL, sia quando LAL è stata determinata con metodo HPLC fluorimetrico che con procedura LC-ESI/MS/SIM.
Esiste una relazione lineare tra quantità di proteina essiccata aggiunta al latte e quantità di LAL nel formaggio, ma non è tuttavia possibile, sulla base della quantità di LAL misurata, determinare la quantità di proteina essiccata aggiunta, se l’analista non è in possesso anche della polvere aggiunta, per il contenuto estremamente variabile di LAL nei derivati in polvere.
La complessità del sistema caseario e la forte eterogeneità dei preparati commerciali disponibili sul mercato nazionale ed internazionale rendono tuttavia ancora difficile l’identificazione certa della varietà della proteina essiccata eventualmente aggiunta (caseinato o PCL):  alla luce dei risultati ottenuti è oggi infatti possibile distinguere con una discreta presunzione di attendibilità formaggi ottenuti con l’uso di caseinato da quelli ottenuti con PCL  sulla base dei differenti contenuti in LAL e furosina o sulla base della identificazione della presenza di _s1 caseina lattosilata o modificata dalle reazioni di _ eliminazione e cross linking.
La validità assoluta di tale approccio analitico, e quindi la sua applicabilità anche in termini normativi, deve essere tuttavia confermata sia ampliando il numero dei casi allo studio sia verificando in che modo l’uso combinato di tali marcatori sia in grado di discriminare formaggi ottenuti con addizione di PCL (in cui è presente sia LAL che furosina) da quelli ottenibili con aggiunte combinate di caseinato (in cui è presente LAL) e latte in polvere (in cui è presente furosina), argomento questo che non era tra gli obiettivi previsti inizialmente dal progetto, ma di cui i risultati del progetto evidenziano l’utilità.
Lo studio di altri marcatori, che evidenziano modificazioni delle proteine essiccate in funzione dei trattamenti alla base del loro ottenimento, ha offerto interessanti spunti per implementare le ricerche.
I risultati del progetto ed i metodi analitici messi a disposizione consentono in ogni caso di difendere i formaggi DOP italiani nei quali è esclusa a priori la possibilità di uso di qualsiasi derivato essiccato del latte. Sarà possibile  esprimere eguale certezza  anche nel caso dei formaggi “comuni”, solo quando saranno a disposizione marcatori specifici o sistemi combinati di valutazione in grado di discriminare con certezza il tipo di derivato essiccato del latte.


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Unità Operative linea SIFORTI

Denominazione: Università degli Studi di Milano - Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche (DISTAM)
Indirizzo: Via Celoria, 2 - 20133 Milano
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Telefono/Fax: 02 58356664
e-mail: luisa.pellegrino@unimi.it


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Telefono/Fax: 0825 299208 / 0825 299206
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Denominazione: Istituto Sperimentale Lattiero Caseario(ILC)
Indirizzo: Via Lombardo, 11 - 26900 Lodi
Referente: prof. Erasmo Neviani - dr. Domenico Carminati
Telefono/Fax: 0371 45011 / 0371 35579
e-mail: eneviani@ilclodi.it


Denominazione: Istituto Zootecnico e Caseario per la Sardegna(IZCS)
Indirizzo: Regione Bonassai - 07400 Olmedo (SS)
Referente: dr. Antonio Pirisi
Telefono/Fax: 079 387277 / 079 387277
e-mail: apirisi@tiscalinet.it


Denominazione:Università degli Studi di Napoli "Federico II" - Dipartimento di Scienza degli Alimenti (DSA)
Indirizzo: Parco Gussone - 80055 Portici (NA)
Referente: dr. Pasquale Ferranti
Telefono/Fax: 081 2539355
e-mail: ferranti@unina.it


Denominazione:Università degli Studi di Napoli "Federico II" - Dipartimento di Scienza degli Alimenti - sez. Microbiologia
Indirizzo: Via Università, 100 - 80055 Portici (NA)
Referente: prof. Salvatore Coppola
Telefono/Fax: 081 2539017
e-mail: sacoppol@unina.it


Denominazione:Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna (IZSLER)
Indirizzo: Via Bianchi, 7 - 25100 Brescia
Referente: dr. Paolo Boni
Telefono/Fax: 030 2290545 / 030 2290556
e-mail: soepidal@bs.izs.it


Denominazione:Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna - sez. Microbiologia Latte e derivati (IZS S)
Indirizzo: Via Duca degli Abruzzi, 8 - 07100 Sassari
Referente: dr. Antonio Fadda
Telefono/Fax: 079 219670 / 079 272189
e-mail: antonio.fadda@izs-sardegna.it


Denominazione:Consorzio per la Tutela del Formaggio Grana Padano
Indirizzo: Via XXIV Giugno, 8 - Loc. S. Martino della Battaglia - 25015 Desenzano del Garda (BS)
Referente: dr. Stefano Berni
Telefono/Fax: 030 9109811 / 030 9910487
e-mail: m.malagrida@tin.it


Denominazione:Consorzio per la Tutela del Formaggio Pecorino Romano
Indirizzo: Corso Umberto, 226 - 08015 Macomer
Referente: P.A. Giovanni Galistu
Telefono/Fax: 0785 70537 / 0785 72215
e-mail: romano.galistu@tiscalinet.it


Denominazione:CHELAB S.r.l.
Indirizzo: Via Fratta, 25 - 31023 Resana (TV)
Referente: dr. ssa Ingrid Munari
Telefono/Fax: 0423 717888 / 0423 715058
e-mail: i.munari@chelab.it












Unità Operative linea GEFORPASTA



Denominazione: Università degli Studi di Milano - DISTAM, Sezione Industrie Agrarie
Indirizzo: Via G. Celoria, 2 - Milano
Referente: prof. Luisa Pellegrino
Telefono/Fax: 02 58356668 / 02 58356672
e-mail: luisa.pellerino@unimi.it


Denominazione: Università degli Studi di Napoli "Federico II" - Dipartimento di Scienza degli Alimenti
Indirizzo: Parco Gussone - 80055 Portici (NA)
Referente: prof. Lina Chianese
Telefono/Fax: 081 2539011
e-mail: chianese@unina.it


Denominazione: CNR - Istituto di Scienze dell'Alimentazione (ISA)
Indirizzo: Via Roma, 52 a/c - 83100 Avellino
Referente: prof. Francesco Addeo
Telefono/Fax: 0825 2991111
e-mail: addeo@unina.it


Denominazione: Istituto Sperimentale Lattiero Caseario (ISLC)
Indirizzo: Via Lombardo, 11 - 26900 Lodi
Referente: dr. Germano Mucchetti
Telefono/Fax: 0371 45011 / 0371 35579
e-mail: gmucchetti@ilclodi.it


Denominazione: CHELAB S.r.l.
Indirizzo: Via Fratta, 25 - 31023 Resana (TV)
Referente: dr. Ingrid Munari
telefono/Fax: 0423 717888 / 0423 715058
e-mail: i.munari@chelab.it


Denominazione: CNR - Istituto di Genetica Vegetale, Sezione di Portici
Indirizzo: Via Università, 133 - 80055 Portici (NA)
Referente: prof. Luigi Monti
telefono/Fax: 081 2539047 / 081 7753579
e-mail: lmonti@unina.it









Budget


VALORE
FINANZIAMENTO MIUR
COFINANZIAMENTO UU.OO.
€ 1.549.370,70
€ 1.032.913,80
€ 516.456,90









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