SCRIGNO
Sviluppo e Caratterizzazione delle
Risorse Genetiche Native in Ortofrutticoltura



Coordinatore: Dr. Giorgio Ancora
ENEA - Divisione Biotecnologie e Agricoltura

Ancora@casaccia.enea.it

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    Descrizione Progetto

    Risultati I Semestre
    Risultati II Anno
    Unità Operative
    Budget






Descrizione Progetto


Le strategie di politica agraria nazionale prevedono che le opportunità di sviluppo per l'agricoltura italiana possono venire soprattutto da politiche miranti a valorizzare i caratteri di qualità e di tipicità legata all'origine geografica e alla tradizione di processo o di prodotto che caratterizzano le produzioni agricole ed agro-industriali Italiane.
Infatti, nei consumatori, sono notevolmente aumentate le esigenze dietetico-salutistiche, nutrizionali, organolettiche, igienico-sanitarie ed ambientaliste, nonchè il bisogno di una maggiore identificazione con uno specifico modello fatto di storia, cultura, tradizioni, radici, legame con un territorio, ecc..
Conseguentemente, va sempre più delineandosi la possibilità di tipicizzare un prodotto per le sue caratteristiche, per il processo produttivo e per la zona di produzione.
Il Progetto di ricerca SCRIGNO finanziato dal Ministero dell'Università e della Ricerca (MIUR) ha per obiettivo la valorizzazione delle risorse genetiche autoctone impiegate per la produzione di prodotti tipici, mediante caratterizzazione morfo-fisiologica e molecolare, e mediante analisi del contenuto di sostanze attive con effetti sulla salute e sul benessere.
Nell'ambito del Progetto si prevede, inoltre, di costruire un database con la catalogazione delle risorse genetiche utilizzate per le produzioni tipiche nelle specie considerate e delle loro caratteristiche.
Le specie prese in considerazione dal Progetto sono le seguenti: Pomodoro, Carciofo, Ciliegio, Fagiolo, Agrumi, Nocciolo, Asparago e Fragola. Nel Progetto di ricerca sono impegnate 20 Unità Operative appartenenti al CNR, all'ENEA e all'Università.










Risultati I Semestre


Pomodoro


U.O.: Università degli Studi di Firenze - Dipartimento di Biologia Animale e Genetica
Referente: Prof. Marcello Buiatti

Titolo della ricerca
A) Analisi della variabilità in pomodoro mediante l'uso di marcatori molecolari funzionali
B) Tutela dei prodotti tipici e protezione della proprietà intellettuale

A) È stato sviluppato un algoritmo per la ricerca di zone ipervariabili dei promotori dei geni LE-ACS4, PAL5, e HMGR2. L’amplificazione delle regioni promotore dei diversi geni è stata effettuata in diverse specie e varietà commerciali e di pomodoro, comprese quelle scelte nell’ambito del progetto, comuni a tutte le U.O.
B) È stata stesa una relazione sullo stato attuale della protezione intellettuale delle varietà secondo la normativa UPOV e con brevetto industriale, nella quale sono stati messi in luce i motivi di conflitto tra i due sistemi ed eventuali soluzioni di mediazione.



U.O.: ENEA-UTS BIOTEC
Referente: Prof. Giovanni Giuliano


Titolo della ricerca
"Profiling" molecolare della tipicità in pomodoro

Crescita piante ed estrazione DNA ed RNA:
Sono state cresciute in serra in condizioni controllate le seguenti varietà:
1 Principe Umberto
2 “Cuore di Bue” toscano
3 Corbarino
4 Moneymaker
5 San Marzano
6 Giallo invernale

Sono stati estratti DNA ed RNA da foglia dalle varietà 1-6 ed RNA da bacche a vari stadi di sviluppo dalle varietà 1-4. I DNA ed RNA di foglia sono stati forniti alle U.O. Breviario e Buiatti per le analisi di loro competenza.

Sequenziamento EST per costruire microarray:
Sono state sequenziate 1.500 EST da una library commerciale di cDNA di bacca in maturazione.



U.O.: Università degli Studi di Perugia - Dipartimento di Biologia Vegetale e Biotecnologie Agroambientali (DBVBA) - Sez. Genetica e Miglioramento Genetico
Referente: Prof. Fabio Veronesi

Titolo della ricerca
Caratterizzazione di popolazioni autoctone di fagiolo e pomodoro nel Centro Italia

(in collaborazione con UR Mazzucato)
Sono stati allevate 17 accessioni e controlli. Su dieci piante per accessione sono stati rilevati 24 caratteri morfo-fisiologici (Fig. 1) e da 4 estratto il DNA per la caratterizzazione molecolare. 4 STMS hanno già mostrato polimorfismo e saranno analizzati su tutte le piante.





Fig. 1. Caratteristiche del frutto di alcune varietà locali di pomodoro oggetto di studio.
I nomi riportati sono quelli attribuiti dagli agricoltori. La barretta di riferimento misura 5 cm.




U.O.: Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) - Istituto di Genetica Vegetale, Sezione di Portici
Referente: Prof. Luigi Monti

Titolo della ricerca
Valorizzazione del pomodoro attraverso l'uso di marcatori molecolari associati a caratteri qualitativi e nutrizionali


È stata effettuata la caratterizzazione morfo-fisiologica di 15 ecotipi di pomodoro campano ascrivibili alle tipologie San Marzano, Vesuviano e Corbarino (Figura 1). Sei ecotipi sono stati valutati anche per contenuto in carotenoidi, flavonoidi, e per attività antiossidante lipofila ed idrofila. È stata effettuata l'analisi QTL, per dieci caratteri d'interesse, delle 50 linee di introgressione (IL) di L. pennellii (acc. LA716) in L. esculentum (cv. M82). È stata iniziata la mappatura fine di QTL di origine selvatica in grado di aumentare l'intensità del colore rosso ed il contenuto in solidi solubili della bacca. Al fine di identificare geni candidati di questi QTL, è stata avviata l'analisi trascrizionale cDNA-AFLP di due QTL-NIL.


Fig. 1. Caratteristiche del frutto di ecotipi di pomodoro campano



U.O.: Università degli Studi della Tuscia, Viterbo
- Dipartimento di Agrobiologia e Agrochimica
Referente: Dr. Andrea Mazzucato

Titolo della Ricerca
Identificazione, caratterizzazione e valorizzazione di varietà locali di pomodoro autoctone dell'Italia centrale

In collaborazione con la U.R. Veronesi è stata allevata una collezione di accessioni di pomodoro comprendente tipi locali dell’Italia centrale (58), tipi locali commerciali (8), varietà (5) e specie selvatiche (2). Su una base di dieci piante, ciascuna accessione è stata caratterizzata da un punto di vista morfo-fisiologico (Fig. 1A). Da 4 piante per accessione è stato estratto il DNA per una caratterizzazione molecolare con marcatori STMS. Sono in fase di valutazione 25 marcatori STMS (Fig. 1B), di cui 14 mappati e 19 individuati in sequenze espresse; 20 di essi saranno analizzati su tutte le piante, sempre in collaborazione con la U.R. Veronesi.



Figura 1A. Esempio di "scheda varietale" redatta sulla base dell'analisi morfo-fisiologica
per uno dei tipi locali di pomodoro in valutazione

Figura 1B. Esempio di marcatore STMS che
dimostra polimorfismo tra accessioni



U.O: CNR - Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria (IBBA)
Referente: Dr. Diego Breviario

Titolo della Ricerca
Carte di identità genetico-molecolari a tutela della tipicità dei prodotti agricoli e di nicchia

Sono state consultate le banche dati per la presenza di regioni genomiche di beta-tubulina di pomodoro e non si sono trovate informazioni adeguate a disegnare una procedura TBP (Tubulin Based Polymorphism) specifica per questa pianta. Sono stati così utilizzati coppie di primers "universali" che hanno già identificato polimorfismi di varietà in altre specie. I risultati ottenuti utilizzando il primo introne della regione codificante come elemento di variabilità sono stati negativi e l'utilizzo del secondo introne ha rivelato un solo polimorfismo presente nelle varietà giallo. Si stanno perfezionando nuove strategie di analisi sempre basate su sequenze bersaglio di regioni non codificanti di beta-tubulina.






Carciofo

U.O.: ENEA-UTS BIOTEC
Referente: Dr. Giorgio Ancora

Titolo della Ricerca
Isolamento, caratterizzazione e propagazione in vitro di cloni di carciofo (Cynara scolymus L.) di cultivar primaverili

Nei primi sei mesi di attività del progetto sono state isolate piante di carciofo della cv. “Romanesco” da carciofaie presenti in diversi comuni del Lazio.
Il materiale isolato è stato sterilizzato e apici vegetativi sono stati trasferiti in coltura in vitro per la moltiplicazione e la produzione di piantine micropropagate per la valutazione morfofisiologica e produttiva del materiale. Sono stati definiti terreni di coltura per le diverse fasi della moltiplicazione in vitro.
La collezione in vitro del materiale (28 cloni) è stata messa a disposizione della U.O. dell’Università di Viterbo per la caratterizzazione molecolare e biochimica.







U.O.: Università degli Studi della Tuscia, Viterbo
Referente: Prof. Francesco Saccardo


Titolo della Ricerca
Identificazione e valorizzazione delle risorse genetiche autoctone di ecotipi di carciofo ( Cynara scolymus L.)

Si è raccolto germoplasma di Carciofo tipo “Romanesco” e tipo “Tondo di Paestum”. Per ogni tipo si sono trovate 3 aziende e da ciascuna sono stati raccolti 30 genotipi ed estratto il DNA, per stimare la variabilità esistente entro e tra ecotipi. Per il “Romanesco”, in collaborazione con l’ENEA, sono stati collezionati 25 genotipi, con caratteristiche contrastanti, che sono in conservazione in vitro e presso un campo catalogo del ARSIAL. Si sono individuati alcuni marcatori AFLP da utilizzare. È stato, inoltre, messo a punto il metodo analitico per l’estrazione di acido clorogenico.



U.O.: Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) - Istituto di Genetica Vegetale - Sede di Bari
Referente: Dr. Gabriella Sonnante

Titolo della ricerca
Studio della diversità genetica, caratterizzazione e valorizzazione di germoplasma di Cynara cardunculus var. scolymus L .

È stata costituita una libreria genomica di carciofo, var. "Locale di Mola", in fago. Lo screening di circa 1000 pfu utilizzando come sonda l’oligo (CAT) 8 ha permesso di isolare dei cloni fagici positivi (Fig.1), alcuni frammenti dei quali sono stati ulteriormente subclonati e sequenziati. Il sequenziamento di 3.000 bp ha permesso di evidenziare 9 microsatelliti: (TCA) 9 , (AGG) 6 , (CCA) 8 , (TG) 5 , (GTG) 4 , (CTG) 7 , (TG) 11 , (AC) 9 AT(AC) 4 , (GA) 8 . Sono in corso analisi di amplificazione delle regioni ripetute utilizzando primer disegnati sulle sequenze fiancheggianti.
Sono state avviate analisi AFLP per individuare le migliori combinazioni di primer in carciofo.




Fig. 1 Plasmide ricombinante digerito con diversi enzimi di restrizione (da sinistra a destra: clone MC 241 con gli enzimi RsaI, ApaI, TaqI, AluI, HaeIII, HinfI e clone MC221 con gli enzimi BigIII, RsaI, TaqI, AluI, HaeIII, HinfI, HindIII) e ibridati con (CAT) 8 .



Ciliegio


U.O.: Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) - Istituto di Genetica Vegetale, Sezione di Perugia
Referente: Dr. Sergio Arcioni

Titolo della Ricerca
Riconoscimento varietale in ciliegio mediante marcatori molecolari

Nel primo semestre l'UO PG-IGV ha analizzato il DNA di antiche cv di Prunus avium con vari tipi di marcatori molecolari. Dai risultati ottenuti si può dedurre che è possibile distinguere tutte le cv analizzate con marcatori AFLP. Al fine di minimizzare le risorse necessarie per le analisi sono state sviluppate due tecniche di fingerprinting . Il MIMAP si basa sull'amplificazione di segmenti genomici con un primer marcato disegnato sulla base di una sequenza minisatellitaria ed un primer (non marcato) disegnato sulla base del motivo ripetitivo di SSR. La seconda, denominata REMAP usa un primer marcato disegnato sulla sequenza di un LTR di un retrotrasposone di Prunus avium. Entrambe le tecniche producono fingerprints con un minimo impiego di risorse.



U.O.: Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) - Istituto per la Valorizzazione del Legno e delle Specie Arboree
Referente: Prof. Giancarlo Roselli

Titolo della Ricerca
Caratterizzazione del germoplasma di ciliegio toscano ed umbro

Sono stati reperiti genotipi nelle provincie toscane di FI, LU, AR, PT e GR e nella Regione Umbria (PG). La descrizione è stata fatta con descriptor list predisposto dalla Commissione per la Tutela delle Risorse Genetiche autoctone della Toscana. La propagazione e conservazione in vitro è stata iniziata con le cultivar di maggiore interesse agronomico. La caratterizzazione molecolare viene condotta con vari metodi in collaborazione con l'U.O. di Perugia. Sui frutti sono state effettuate analisi strumentali, chimiche, colorimetrica, sensoriale e analisi quali quantitative delle antocianine.


Fagiolo

U.O.: Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) - Istituto di Genetica Vegetale - Sez. di Bari
Referente: Dr. Gaetano Laghetti

Titolo della Ricerca
Identificazione, caratterizzazione e valorizzazione di agro-ecotipi di fagiolo fresco italiani

Per la realizzazione della prove agronomiche, si sono allestiti dei campi sperimentali in due località (Villa d’Agri e Senise) della Basilicata (Fig. 1). A Villa d’Agri si sono effettuati il ringiovanimento, la moltiplicazione e la caratterizzazione di un segmento (50 accessioni di origine italiana) della collezione di germoplasma di fagiolo conservata nel genebank di Bari. Inoltre, in collaborazione con l’U.O. di Potenza, si sono valutati sedici ecotipi in due località, allo scopo di studiarne (in due annate) l’interazione genotipo x ambiente. Su tutto il germoplasma in prova si sono registrati 15 descrittori morfo-agronomici (ancora in fase di elaborazione) e creata una prima banca dati sugli ecotipi di fagiolo italiani (ca. 500 censiti).




Figura 1. Vista dei due campi sperimentali di Senise (a sinistra) e Villa d'Agri (a destra). In ciascuna prova
sono stati seminati separatamente gli agroecotipi di fagiolo rampicanti e quelli nani



U.O.: Università degli Studi della Basilicata - Dipartimento di Biologia, Difesa, Biotecnologie Agroforestali Referente: Prof. Pier Luigi Spagnoletti Zeuli

Titolo della Ricerca
Identificazione e valorizzazione di risorse genetiche di fagiolo comune dei bacini idrografici del Mezzogiorno d'Italia per una agricoltura sostenibile






U.O.: Università degli Studi della Tuscia - Dipartimento di Agrobiologia e Agrochimica,
Referente: Prof. Oronzo Antonio Tanzarella

Titolo della Ricerca
Identificazione e valorizzazione delle risorse genetiche autoctone di Phaseolus coccineus

Sono state reperite 53 accessioni di Phaseolus coccineus provenienti da 11 regioni italiane. È in corso l'analisi della variabilità dei profili delle proteine del seme mediante elettroforesi SDS-PAGE. Sono stati analizzati i profili proteici di 10 semi per ognuna di 25 accessioni, per un totale di 250 genotipi. È stata rilevata un'ampia variabilità sia entro che tra accessioni per presenza/assenza di faseoline e nella regione delle lectine. È in corso l'estrazione del DNA, che è stata già effettuata da 10 genotipi di 8 accessioni, per un totale di 80 genotipi. Sono state messe a punto le tecniche di analisi con marcatori AFLP e RAPD su un numero limitato di genotipi.



U.O.: Università degli Studi di Perugia - Dipartimento di Biologia Vegetale e Biotecnologie Agroambientali (DBVBA) - Sez. Genetica e Miglioramento Genetico
Referente: Prof. Fabio Veronesi

Titolo della ricerca
Caratterizzazione di popolazioni autoctone di fagiolo e pomodoro nel Centro Italia


Sono state allevate 7 accessioni e controlli, rilevati 10 caratteri morfo-fisiologici ed estratto il DNA.Venti marcatori SSR vengono attualmente provati per trovare polimorfismo (Fig. 2).






Agrumi


U.O.: ENEA-UTS BIOTEC
Referente: Dr. Sergio Lucretti

Titolo della Ricerca
Valorizzazione Agrumi Italiani

È stata iniziata la caratterizzazione del germoplasma tramite citofluorimetria e marcatori molecolari. Sono state effettuate più di 300 analisi di ploidia per identificare triploidi da incroci prodotti da limone 2n per ibridi somatici 4n. Sono stati identificati più di 60 piante 3n, in corso di caratterizzazione tramite SE-AFLP. Tramite RAPD sono stati analizzati l’arancio Tarocco “Scirè”, il mandarino Avana, Avana Apireno e Tardivo di Ciaculli (C. deliciosa ), il Clementine (C. reticulata ) ed il portainnesti ibrido Cleopatra (C. sinensis X C. reticulata ). È stato costruito un dendrogramma di somiglianza e sono stati individuati primer con bande uniche discriminanti.







U.O.: Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) - Istituto di Genetica Vegetale, Sezione di Palermo
Referente: Dr. Nicasio Tusa

Titolo della Ricerca
Valorizzazione del germoplasma autoctono Siciliano

Sono stati raccolti nuovi cloni di limone, arancio e mandarino provenienti dalla Sicilia occidentale. Si è implementata la collezione limonicola con la produzione di ibridi provenienti da incroci tra selezioni locali di limone ed ibridi somatici simmetrici e asimmetrici (Fig. 1).
Sono stati raccolti alcuni cloni di bergamotto e di chinotto per l'industria degli olii essenziali e farmaceutica, e circa 30 cloni di arancio amaro da testare come portinnesti.
Si è iniziata la caratterizzazione citofluorimetrica, biochimica (isoenzimi) e molecolare (ISSR-PCR) della collezione in esame.





Nocciolo

U.O. : ENEA-UTS BIOTEC
Referente: Dr. Loretta Bacchetta

Titolo della Ricerca
Utilizzo di metodi molecolari per la caratterizzazione di genotipi locali di nocciolo (Corylus avellana) selezionati per caratteri agronomici e merceologici

Lo studio della variabilità intra-varietale è stato condotto attraverso l’elaborazione di un questionario e la raccolta dati in alcuni comuni corilicoli del viterbese. Le informazioni ottenute hanno riguardato le caratteristiche aziendali, le pratiche colturali adottate e la presenza di piante differenti dalla Tonda Gentile Romana per epoca di fruttificazione, produzione di polloni e caratteristiche delle nucule. È in corso l’analisi fenotipica della variabilità inter-varietale con i rilevamenti sulle caratteristiche carpologiche e merceologiche delle principali varietà italiane. È iniziata la caratterizzazione varietale con la tecnica RAPD che ha previsto l’estrazione di DNA da 11 varietà italiane e 6 mediterranee e l’impiego di 75 primer. Sono stati finora selezionati 6 primer in grado di mostrare polimorfismi varietali. Le prove di micropropagazione hanno dimostrato che, tra gli espianti a gemma dormiente, la gemma singola origina un maggior numero di espianti reattivi il cui accrescimento risulta migliore nel substrato contenente da 2 a 5 mg/l BAP.



Asparago


U.O.: Seconda Università degli Studi di Napoli - Dipartimento di Scienze della Vita
Referente: Prof. Augusto Parente

Titolo della Ricerca
Caratterizzazione biochimica e genetica di popolazioni di Asparagus acutifolius L. e valorizzazione della sua coltivazione

L'analisi dei marcatori RAPD condotta su differenti popolazioni italiane di A. acutifolius ha consentito di individuare frammenti di amplificazione esclusivi per la maggior parte di esse.
L'analisi microsatellitare ha consentito di caratterizzare 7 loci microsatellitari.
È stata anche avviata la caratterizzazione delle proteine totali di semi di A. acutifolius e di A. officinalis mediante elettroforesi bidimensionale.
È stata intrapresa, infine, la determinazione dei parametri ottimali per la germinazione dei semi di A. acutifolius notoriamente dormienti.



Fragolina di bosco


U.O.: Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) - Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA) - Sezione di Lecce
Referente: Dr. Giuseppe Zacheo

Titolo della Ricerca
Valorizzazione di biotipi italiani di fragolina di bosco (Fragaria vesca, L.) mediante analisi genetica e molecolare dell'aroma

Sono state identificate le principali componenti aromatiche di fragola e fragolina di bosco e sono state stimate le variazioni qualitative di questi composti nel corso della maturazione.
È stata studiata la via delle lipossigenasi che porta alla biogenesi di aldeidi e alcoli volatili in fragole a diversi stadi di maturazione.
Sono stati identificati alcuni polimorfismi AFLP che corrispondono a mRNA differentemente espressi durante lo sviluppo dei frutti di fragola.
È stata condotta l'analisi proteomica su fragole raccolte a tre stadi di sviluppo e sono state identificate alcune proteine differentemente espresse durante la maturazione.






Varie specie

U.O. ENEA UTS BIOTEC
Referente: Dr. Giovanni Vita

Titolo della ricerca
Identificazione delle risorse genetiche di specie orticole e frutticole impiegate per le produzioni tipiche mediterranee e valorizzazione delle caratteristiche salutistiche dei prodotti tipici ortofrutticoli.

È stata reperita la documentazione utile per i prodotti tipici, tradizionali e varietà autoctone. In particolare, si è catalogata la normativa, i disciplinari di produzione, il materiale iconografico e fotografico le aree di diffusione ed il materiale descrittivo. Ogni dato è stato trasferito sul supporto informatico in forma di banca-dati dotata di opzioni cartografiche.
Si è realizzato uno studio sul valore salutistico delle specie di interesse del progetto. Allo stato dell’arte, si conoscono tutte le sostanze chimiche di ciascuna specie e la correlazione conosciuta tra sostanza chimica e salute umana. Anche questi dati saranno inclusi nella banca-dati generale.
Sono state prescelte le metodologie analitiche per la determinazione degli antiossidanti fenolici nelle piante.








Risultati II Anno


Il progetto SCRIGNO finanziato dal MIUR nell’ambito della legge 449/97 aveva tra i suoi obiettivi il recupero, la caratterizzazione e la valorizzazione delle risorse genetiche autoctone impiegate per la produzione di prodotti tipici, mediante caratterizzazione morfo-fisiologica e molecolare, e mediante analisi del contenuto di sostanze attive con effetti sulla salute e sul benessere.
Al progetto hanno partecipato 20 Unità Operative, del CNR, dell’ENEA, dell’Università di Firenze, dell’Università della Tuscia e dell’ Università della Basilicata. Le attività di ricerca afferivano a Linee di attività denominate : POMODORO, CARCIOFO, FAGIOLO, CILIEGIO, AGRUMI, NOCCIOLO, ASPARAGO ,  FRAGOLA,  ALTRE SPECIE e CONFERENZA NAZIONALE, che, com’è evidente, in gran parte si identificano con le specie oggetto di studio (pomodoro, carciofo, fagiolo, ciliegio, arancio, mandarino, nocciolo, asparago e fragola) più la linea di attività “ALTRE SPECIE” che aveva obiettivi che riguardavano più specie e la Linea “CONFERENZA NAZIONALE “, che aveva come obiettivo l’organizzazione di una conferenza nazionale che facesse il punto sulle ricerche relative alla salvaguardia e alla valorizzazione degli ecotipi vegetali italiani, che si è tenuta nei giorni 6 e 7 ottobre 2004 a conclusione del secondo anno di attività del Progetto.
L’analisi delle attività svolte nel biennio dalle diverse Unità Operative ha messo in evidenza risultati di notevole valore scientifico e pratico nello stesso tempo. Infatti, le ricerche hanno portato al reperimento e valutazione di materiali genetici talvolta dimenticati, che invece alla luce degli studi che sono stati effettuati, hanno evidenziato grandi potenzialità di utilizzazione sia per capacità produttive che, soprattutto, per le caratteristiche qualitative e di contenuti in termini di sostanze con attività che esplicano effetti positivi sulla salute. D’altra parte, gli studi di caratterizzazione genetica e molecolare avviati con questo progetto avviano il processo di una maggiore valorizzazione di questi materiali genetici perchè potranno anche essere più facilmente salvaguardati grazie al loro agevole riconoscimento reso possibile dallo sviluppo di adeguate tecniche di fingerprinting genetico. Questi materiali genetici, inoltre sono importanti anche per i fututri programmi di miglioramento genetico delle specie considerate.  Per quanto riguarda invece gli aspetti più propriamente scientifici alcuni risultati ottenuti avviano concretamente la possibilità di legare le caratteristiche di prodotti tipici a precise funzioni geniche espresse in precise condizioni ambientali e/o colturali.
L’analisi dei risultati ha mostrato che le diverse Unità Operative hanno sostanzialmente raggiunto gli obiettivi che si erano proposti anche se è auspicabile che si possa trovare l’oppotunità di popter proseguire gli studi e le sperimentazioni con e sui materiali genetici individuati al fine approfondirne potenzialità e caratteristiche.

Gli obiettivi della ricerca ed i risultati ottenuti nel biennio di attività dalle diverse UU.OO. vengono di seguito riassunti con riferimento alle diverse Linee di attività a cui afferiscono:



Linea di attività “POMODORO”
A questa Linea di attività hanno partecipato le 6 UU.OO. di seguito riportate:   

1. U.O. UNIVERSITA’ DI FIRENZE – DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE E GENETICA (Responsabile Prof. Marcello Buiatti)

Titolo della ricerca:

A)Analisi della variabilità in pomodoro mediante l’uso di marcatori molecolari funzionali
B)Tutela dei prodotti tipici e protezione della proprietà intellettuale

L’U.O. del prof. Buiatti si proponeva di studiare le variazioni di sequenza nelle regioni promotore di geni con effetto pleiotropico sullo sviluppo e differenziamento, riproduzione e difesa delle piante con lo scopo di sviluppare marcatori molecolari “funzionali” per la regolazione quantitativa dell’espressione genica.
Durante il primo anno di attività è stato utilizzato l’algoritmo STRETCHES, messo a punto, per la ricerca di sequenze potenzialmente ipervariabili (sequenze omogenee a bassa complessità). Con questo algoritmo sono stati analizzati i promotori dei geni ACS4 che codifica per una ACC sintasi tessuto specifica (via biosintetica dell’etilene), del gene che codifica per l’isoforma 5 della fenilalanina ammonia liasi (PAL5, via dei fenilpropanoidi) e del gene per l’isoforma 2 della idrossimetil-glutaril-CoA reduttasi (HMGR2, via degli isoprenoidi). Per ciascun promotore sono state disegnate coppie di primers fiancheggianti le regioni ricche di sequenze potenzialmente ipervariabili, ed utilizzate per l’amplificazione PCR in diverse specie e cultivars commerciali di  pomodoro. Gli amplificati sono stati quindi clonati in plasmidi e sottoposti ad analisi della sequenza. L’allineamento delle sequenze con algoritmi disponibili in rete ha evidenziato variazioni del numero di sequenze omogenee (ripetizioni semplici, microsatelliti) ed una serie di SNPs e INDELS in tutti i promotori analizzati. Alcune variazioni di sequenza sono state localizzate dentro o vicino ad elementi cis-acting per specifici fattori di trascrizione. Tutte le variazioni riscontrate potrebbero influenzare la geometria strutturale del promotore e, di conseguenza, la regolazione genica. Per cercare di verificare questa ipotesi è stata valutata l’espressione del gene ACS4 in  individui di  due cultivars di pomodoro che presentano una elevata omologia del background genetico e differenze nell’habitus della pianta, ed elevato polimorfismo a livello del promotore. Il gene ACS4 si esprime soltanto durante la fase di maturazione dei frutti. L’espressione genica è stata pertanto determinata, mediante PCR Real Time, in frutti a diversi stadi di maturazione, verde immaturo e invaiato, in seguito a trattamenti con 500 µM di acido abscissico (ABA) o di acido indolacetico (IAA). Nel promotore del gene ACS4 sono presenti elementi di risposta a questi ormoni. I risultati dell’analisi hanno indicato una modulazione differenziale dell’espressione del gene ormone-dipendente, inibendo i livelli di messaggero negli individui di una cultivar e, viceversa aumentandoli, negli individui dell’altra. Questi risultati sono quindi in accordo con l’ipotesi e dimostrano che è possibile sviluppare “marcatori funzionali” per la regolazione quantitativa dell’espressione genica.
La stessa U.O. ha inoltre prodotto materiale documentale sul rapporto fra protezione della proprietà intellettuale e tutela del germoplasma a livello nazionale ed internazionale elaborando una relazione sullo stato attuale della protezione intellettuale delle varietà secondo la normativa UPOV e con brevetto industriale, nella quale sono stati messi in luce i motivi di conflitto tra i due sistemi ed eventuali soluzioni di mediazione.


2. CNR- ISTITUTO PER IL MIGLIORAMENTO GENETICO DELLE PIANTE DA ORTO E DA FIORE  (Responsabile  Prof. Luigi Monti)

Titolo della ricerca:
Identificazione di marcatori molecolari associati a caratteristiche nutrizionali della bacca di pomodoro

L'obiettivo del progetto era la valorizzazione della variabilità genetica presente sia in germoplasma coltivato sia in germoplasma selvatico del genere Lycopersicon. Di conseguenza, l'attività di ricerca ha coinvolto sia la caratterizzazione di ecotipi di pomodoro campano sia la caratterizzazione di linee quasi isogeniche (NIL/IL) contenenti QTL (Quantitative Trait Loci) di origine selvatica in grado di migliorare la qualità organolettica e nutrizionale del pomodoro. Al fine di garantire un efficiente utilizzo di questa variabilità genetica in programmi di breeding assistito è necessaria l'identificazione di marcatori molecolari associati ai geni chiave che influenzano i caratteri d’interesse. Per il raggiungimento di questo obiettivo sono state utilizzate due strategie parallele: una mirata alla mappatura fine dei QTL selezionati utilizzando l'approccio delle linee di sostituzione ed un'altra mirata all'identificazione di geni candidati dei QTL attraverso l'analisi trascrizionale di QTL-NIL e mediante la localizzazione cromosomica di geni a funzione nota. Per la caratterizzazione degli ecotipi di pomodoro, sono stati collezionati sedici ecotipi campani ascrivibili alle tipologie San Marzano, Vesuviano e Sorrento. Ciascun ecotipo è stato caratterizzato da un punto di vista morfo-fisiologico, ed  un subset di 6 ecotipi è stato valutato anche per le seguenti caratteristiche analitiche della bacca: colore, contenuto in carotenoidi, flavonoidi ed attività antiossidante lipofila ed idrofila. I dati indicano correlazioni positive fra il colore ed il contenuto in carotenoidi; fra il colore ed il contenuto in flavonoidi e fra contenuto in carotenoidi e l'attività antiossidante lipofila.  I valori osservati sia per il contenuto in licopene che per la quercetina sono risultati mediamente bassi.
Nel secondo anno l’attenzione è stata posta sul contenuto di saponine steroidali. Nelle specie del genere Lycopersicon, è accumulata una particolare saponina steroidale nota come a–tomatina, che gioca un ruolo importante sia nella difesa delle piante, agendo come fitoanticipina nei confronti di funghi, virus, batteri ed insetti e sia assumendo un ruolo importante nella dieta umana per la nota attività anticolesterolemica. Inoltre, sebbene la a–tomatina altera le membrane cellulari diversi studi mostrano che la tossicità orale di queste molecole è bassa soprattutto se compartata con quella di altri glicoalcaloidi come la solanina. Allo scopo, un subset costituito da cinque ecotipi campani (San Marzano, Corbarino, Sorrento, Vesuviano e Perino giallo) è stato caratterizzato per il contenuto di saponine steroidali adottando un test semiquantitativo con Trichoderma viride, fungo saprofita particolarmente sensibile a questi metaboliti secondari. Sono stati quindi realizzati saggi impiegando farine ottenute da diversi organi (foglie, radici e frutti) che hanno mostrato una maggiore inibizione della crescita del micelio con farine provenienti dalla parte aerea degli ecotipi S. Marzano, Corbarino e Perino giallo, mentre quelle della parte ipogea si comportano come il controllo. Inoltre, negli ecotipi S. Marzano e Corbarino il contenuto di a-tomatina risulta essere significativamente più alto nel frutto verde che in quello rosso.  Questi risultati concordano con i dati di letteratura che riportano come il contenuto di questo metabolita nei frutti immaturi può essere anche 10 volte maggiore che in quelli maturi.
Nell’ambito del progetto SCRIGNO è stato avviato l’isolamento di geni coinvolti nel pathway biosintetico di questi metaboliti secondari mediante tecniche di PCR con primer degenerati che hanno permesso di amplificare diversi frammenti che sono stati clonati in vettori plasmidici e dal cui sequenziamento sarà possibile disegnare primer specifici al fine di applicare tecniche di RACE-PCR per l’amplificazione dei full-length.
Per l’identificazione di marcatori molecolari associati a caratteri influenzanti la qualità organolettica e nutrizionale della bacca di pomodoro sono state valutate popolazioni QTL-NIL di L. pennellii e di L. hirsutum. L’analisi agronomica condotta nel primo anno ha permesso di confermare che la base del cromosoma 4 del pomodoro è una regione di particolare interesse perché contiene alleli QTL della specie selvatica in grado di migliorare il contenuto in solidi solubili e l’intensità del colore dei frutti, oltre che influenzare altri caratteri importanti per la qualità organolettica quali forma e dimensione dei frutti. Pertanto, al fine di trovare marcatori più strettamente legati ad i QTL d’interesse, sono state utilizzate 12 sub-NIL di L. hirsutum disponibii per questa regione e sono stati messi a punto marcatori CAPS per confermare il genotipo delle lNIL già disponibili e per selezionare nuove sub-NIL. I risultati hanno permesso di posizionare con maggior precisione tre dei marcatori analizzati.
Allo scopo di saturare la regione con altri marcatori molecolari, è stata condotta un'analisi AFLP su DNA estratto da L. esculentum (cv E6203), da L. hirsutum (acc. LA1777) e dalla QTL-NIL TA517. Sono state provate 64 combinazioni enzima/primer (usando la coppia di enzimi di restrizione EcoRI e MseI), ed in totale sono stati individuate 46 bande hirsutum-specifiche.
Durante il secondo anno i dodici marcatori CAPS sono stati utilizzati per la selezione assistita di nuove sub-NIL, in grado di migliorare la risoluzione dell’analisi QTL e fornire marcatori più strettamente legati ad i QTL d’interesse. Dall’analisi genotipica delle piante segreganti è stato possibile identificare sia nuove sub-NIL già fissate in omozigoti, sia piante ricombinanti che segregano per l’intervallo definito dai marcatori T739 e T1203, il cui seme F2 sarà utilizzato per la selezione di ulteriori sub-NIL omozigoti.
Allo scopo di identificare le basi molecolari dei QTL in studio, parallelamente alla mappatura fine dei QTL della base del cromosoma 4, è stata perseguita anche la localizzazione cromosomica di geni a funzione nota e l'analisi trascrizionale di QTL-NIL con le tecniche cDNA-AFLP e microarray. I geni associati alla via biosintetica dei carotenoidi sono ovvii candidati per i QTL che modificano l'intensità del colore rosso ed il contenuto in licopene dei frutti; uno di questi, il gene GGPS ("Geranylgeranyl diphosphate synthase"), era stato precedentemente localizzato alla base del cromosoma 4. La popolazione di 12 sub-NIL è stata utilizzata per mappare con maggior precisione questo gene. I risultati ottenuti suggeriscono che GGPS non è il gene candidato del QTL per il colore interno del frutto in esame. Infine, in collaborazione con il Prof. Jim  Giovannoni del Boyce Thompson Institute for Plant Research, Cornell University, è stato identificato e sequenziato un BAC al fine di trovare altri geni candidati dei QTL di interesse la cui sequenza è in corso d’analisi.
 

3. U.O.: ISTITUTO PER LE BIOSINTESI VEGETALI IN PIANTE DI INTERESSE AGRARIO (IBV) – CNR (Responsabile Dr. Diego Breviario)

Titolo della ricerca:
Carte di identità genetico-molecolare a tutela della tipicità dei prodotti agricoli e di nicchia

Sviluppo di un prototipo per l’estensione del metodo a specie vegetali le cui varietà sono caratterizzate da una forte uniformità genetica dovuta a  fenomeni di erosione genica.
Il metodo che l’U.O. ha validato su fagiolo (vedi Linea Fagiolo) di determinazione di polimorfismi genetici nelle piante basato sull’utilizzo del primo introne presente nella sequenza codificante delle beta-tubuline di piante si è rivelato refrattario alla tipizzazione nel pomodoro, per cui si è elaborato ulteriormente il metodo sviluppando uno schema sperimentale in grado di amplificare sequenze di DNA della regione fiancheggiante al 5’ il codone ATG di inizio della traduzione. Dopo aver valutato la bontà di questo approccio su DNA genomico di   riso, fagiolo, eleusina ed arachide, abbiamo applicato questa variante allo studio del pomodoro. I risultati ottenuti sono molto promettenti. Tre delle varietà analizzate mostrano chiari e specifici polimorfismi e, in particolare, la varietà San Marzano, di notevole interesse commerciale, si associa ad un quadro di amplificazione assolutamente esclusivo e di facile lettura.
I risultati ottenuti confermano l’affidabilità e la convenienza di un metodo di analisi che ha per di più la caratteristica di essere stato interamente sviluppato in Italia su basi scientifiche del tutto originali. Questo metodo si presta molto bene a riconoscere varietà locali (ecotipi) di specie vegetali non ancora caratterizzate geneticamente. Quando già non risolutivo di suo, il TBP, nella sua versione più estesa può generare, da un numero complesso di campioni, sotto-insiemi ordinati per similarità che possono poi essere affidati ad analisi successive più informative ma molto più indaginose (es.SSR) fermo restando che il TBP, al contrario di queste ultime, si affida a sequenze funzionali di DNA e per questo più legate alla specificità biologica della pianta in esame.
Attualmente si sta valutando la possibilità di includere la variante di analisi della porzione 5’fiancheggiante l’ATG, nel brevetto inerente il metodo, depositato a suo tempo. 



4. U.O.: UTS Biotecnologie, Protezione della Salute e degli Ecosistemi, Roma (Responsabile Dr. Giovanni Giuliano)

Titolo della ricerca :
“Profiling” molecolare della tipicità in pomodoro

Per le attività del progetto 6 varietà e tipi locali di pomodoro (Moneymaker, usata come varietà di riferimento, Giallo invernale, Corbarino, Principe Borghese, Cuore di Bue Toscano e San Marzano sono stati allevati in condizioni controllate. Sono state raccolte le foglie e le bacche allo stadio immaturo, breaker, e maturo (10 giorni dopo il breaker). DNA ed RNA totali sono stati isolati da tutti i tessuti sovradescritti e la loro qualità è stata confermata tramite elettroforesi su gel di agarosio.
E’ stato costruito un chip di pomodoro contenente 500 geni immobilizzati. A tale scopo circa 2.000 cDNA da una genoteca commerciale di bacche di pomodoro in maturazione sono stati sequenziati ed analizzati  usando l’algoritmo BlastX contro la banca dati Genbank. 568 cloni + 60 cloni “boutique” (geni della biosintesi dei carotenoidi, fotorecettori, fattori di trascrizione) sono stati spottati su vetrino.
Costruzione e sequenziamento di genoteche SAGE: La SAGE permette di ottenere un profilo di trascrizione globale da organismi per cui non siano disponibili metodi alternativi (microarrays basati su oligonucleotidi o cDNA). Nel corso del progetto si e’ reso disponibile il microarray Tom1 della Cornell University, per cui la necessità del profiling della bacca di varietà tipiche tramite SAGE e’ venuta meno. Ciononostante, e’ stata messa a punto la metodologia di costruzione e sequenziamento automatizzato di genoteche SAGE a partire da RNA di foglie di piante di pomodoro Moneymaker.
Profiling trascrizionale di geni associati alla tipicita’:Sono stati condotti esperimenti di profiling trascrizionale della bacca di pomodoro con il microarray Tom1 ed il microarray “boutique”, sia su bacche Moneymaker in maturazione, sia una comparazione di bacche mature di Corbarino con bacche Moneymaker. Inoltre, al fine di validare il microarray Tom1, sono state ri-sequenziate 768 EST della Cornell University utilizzate per la costruzione di tale microarray.
Ricerca di polimorfismi in geni associati alla tipicità: I DNA delle varietà tipiche forniti ai gruppi del Dr. Breviario e del Dr. Buiatti sono stati utilizzati da tali gruppi per ricercare polimorfismi nei geni della tubulina e nelle regioni promotrici dei geni della biosintesi degli isoprenoidi citoplasmatici e dei flavonoidi. L’U.O. UO ENEA ha focalizzato invece la sua attenzione  sulla via biosintetica dei carotenoidi e su geni differenzialmente espressi fra Coribarino e Moneymaker (RbcS, Lhcp). Le regioni promotrici dei geni summenzionati sono state amplificate e sequenziate per individuare polimorfismi associati alla espressione differenziale e/o al differente contenuto di carotenoidi.
Determinazione del contenuto di carotenoidi in bacche mature: In collaborazione con il gruppo del Prof. P.M. Bramley, della University of London, abbiamo determinato il contenuto di carotenoidi, tocoferoli, e flavonoidi nelle bacche mature (10 giorni post invaiatura) delle varietà tipiche. I dati mostrano una notevole variabilità del contenuto dei carotenoidi. Il contenuto di licopene, il principale antiossidante liposolubile della bacca, responsabile del suo colore rosso, e’ generalmente più elevato nelle varietà tipiche che non nella varietà commerciale (Moneymaker), con la eccezione della varietà Giallo Invernale.



5. U.O.:  DIP. AGROBIOLOGIA E AGROCHIMICA, UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DELLA TUSCIA, VITERBO (Responsabile Dott. Andrea Mazzucato )

Titolo della ricerca:
“Identificazione, caratterizzazione e valorizzazione di varietà locali di pomodoro autoctone dell’Italia centrale”

L’U.O. si è occupata della caratterizzazione morfo-molecolare di una collezione di varietà locali di pomodoro prevalentemente collezionate in Italia centrale in collaborazione con l’Università di Perugia (U.O. Veronesi
E’ stata approntata una collezione di più di 40 varietà locali di pomodoro provenienti essenzialmente dal centro Italia, che ha compreso anche opportuni controlli intra ed interspecifici. Sono stati messi a punto idonei protocolli di allevamento e di rilevamento dei dati che potrebbero venire adottati come standard per la descrizione del germoplasma di pomodoro.
In particolare,  è stato stabilito un elenco di descrittori morfologici, prevalentemente basati sulle linee-guida IPGRI, e molecolari (loci SSR, Simple Sequence Repeats) che si sono dimostrati idonei alla descrizione della collezione e, potenzialmente, a qualsiasi germoplasma di pomodoro di questa tipologia.
La combinazione della descrizione morfologica con quella molecolare ha permesso di discriminare ogni tipologia, nonché di tracciare ipotesi sulle relazioni di parentela o di derivazione di diverse tipologie. Queste informazioni sono particolarmente originali per quanto riguarda l’agro-biodiversità del pomodoro in Italia.
Le analisi effettuate hanno consentito l’identificazione di accessioni omonime e sinonime e quindi distinto i genotipi di mera derivazione da materiale commerciale recente dalle varietà tradizionali originali. Tale potere di risoluzione è considerato di grande valenza in una specie come il pomodoro in cui le tipologie locali rappresentano un panorama molto variegato, per forma, dimensioni e destinazione della bacca, per adattamento e, non ultimo, per origine, denominazione e derivazione genetica.
L’eterogeneità della collezione caratterizzata ha consentito la ricerca e l’individuazione di correlazioni tra caratteristiche morfo-fisiologiche e composizione allelica al locus. Sono state messe in evidenza correlazioni significative tra la presenza di specifici alleli e caratteri importanti come il tipo di accrescimento, il tipo di infiorescenza, la forma, il colore ed il peso della bacca, i suoi diametri, il numero di logge e la tendenza alla scatolatura. Tali informazioni costituiscono un valido punto di partenza per l’individuazione dei determinanti genetici alla base della tipicità dei singoli prodotti, nonché per lo sviluppo di strumenti molecolari da utilizzare nella selezione assistita, sia per la costituzione di nuove cultivar che per il miglioramento delle varietà locali stesse.
Le informazioni ed i dati raccolti sono confluiti nella compilazione di ‘schede varietali’, una per ciascuna accessione, corredate di documentazione fotografica, descrizione completa, rilevamenti sulla fertilità, sulla suscettibilità a patologie o fisiopatie, etc.
Le schede prodotte da questa U.O. saranno unite a quelle prodotte dall’U.O. Veronesi-PG in un CD-ROM e/o in un opuscolo e potranno costituire un punto di partenza e di riferimento per descrivere ordinatamente il patrimonio di varietà locali di pomodoro ancora esistente in Italia.



6. U.O. Università degli Studi di Perugia, Dipartimento di Biologia Vegetale e Biotecnologie Agroambientali (Responsabile Prof. Fabio Veronesi)

Titolo della ricerca:
Individuazione e caratterizzazione di popolazioni autoctone di fagiolo e pomodoro nel centro Italia 

L’U.O. di Peruglia nei corso dei due anni di attività del progetto in stretta collaborazione con le UO di Viterbo (Dr. Mazzucato), ha analizzato un set di 67 accessioni di pomodoro (Lycopersicon esculentum Mill.) (varietà locali impiegate nell’ottenimento di prodotti tipici e come controlli varietà locali provenienti dall’America Latina, cultivar obsolete e forme selvatiche.
Le accessioni sono state allevate in campo e caratterizzate, per aspetti vegetativi e riproduttivi, utilizzando i descrittori morfologici internazionali di maggior interesse. Successivamente dalle stesse piante si è provveduto ad estrarre il DNA e l’intero gruppo di accessioni è stato analizzato con 9 marcatori marcatori molecolari SSR (Simple Sequence Repeats), scelti in base alla loro capacità di evidenziare polimorfismo fra cultivar diverse, alla loro distribuzione sul genoma e a precedenti esperienze di questa UO.  Ciascuna accessione ha mostrato tratti morfologici e profili elettroforetici caratteristici che mostrano la loro peculiare identità. I dati ottenuti indicano che gli agricoltori hanno selezionato nel tempo varietà ben differenziate le une dalle altre e costituite da un insieme di genotipi differenti. Essi evidenziano inoltre come il livello di diversità fra ed entro le varietà locali analizzate sia di entità sostanzialmente maggiore a quanto comunemente pensato.
Tra i risultati della ricerca vi è la stesura, sulla base dei tratti morfo-fisiologici rilevati, di schede varietali relative a ciascuna delle varietà locali di pomodoro oggetto di studio. Tali schede, che come si è detto, saranno unite a quelle prodotte dall’U.O. Mazzuccato-VT in un CD-ROM e potranno essere arricchite con ulteriori informazioni, tra cui i profili molecolari, oltre a costituire uno strumento base di identificazione, di divulgazione e di promozione delle varietà stesse, rappresentano un documento necessario per accedere agli aiuti per la tutela e mantenimento previsti sia dalla Direttiva Europea 98/95 che dalle legislazioni locali.
I risultati ottenuti dalla U.O. evidenziano l’estrema diversità del patrimonio di varietà locali del centro Italia;  confermano i marcatori molecolari come efficace mezzo di indagine della diversità genetica; pongono le basi scientifiche per stabilire la distinguibilità e l’unicità delle varietà locali oggetto di studio; possono essere un concreto ausilio nell’accesso a misure di sostegno alla conservazione delle risorse genetiche autoctone; possono essere utili agli enti preposti alla tutela delle risorse genetiche locali per pianificare azioni di conservazione on farm, le uniche ad essere adeguate ed efficaci per la salvaguardia della diversità genetica di interesse agrario.



Linea di attività “CARCIOFO”

A questa Linea di attività hanno partecipato le 3 UU.OO. di seguito riportate

1. U.O. : ISTITUTO DI GENETICA DEL CNR , SEZ. DI BARI

Titolo della ricerca:
Studio della diversità genetica, caratterizzazione e valorizzazione di germoplasma di Cynara cardunculus var. scolymus" ( Responsabile U.O. Gabriella Sonnante)

Allo scopo di studiare la variabilità genetica ed identificare eventuali marcatori utili per l'identificazione varietale e per risolvere casi di sinonimia, si rende necessario l’uso di marcatori molecolari, quali microsatelliti e AFLP.
A tale scopo è stata costituita una libreria genomica dalla quale sono state isolate regioni contenenti sequenze microsatelliti. In tutto, è stato possibile identificare nove microsatelliti. Il disegno di primer specifici nelle regioni conservate esterne ha permesso di amplificare i microsatelliti ed evidenziare polimorfismi. Salvo alcuni casi, in cui le diverse coppie di primer saggiate non sono state in grado di produrre un prodotto di amplificazione, nella maggior parte dei casi è stato possibile ottenere il frammento contenente il microsatellite e valutare le differenze alleliche in alcune varietà, nelle quali sono stati individuati da 1 a 5 alleli per i diversi microsatelliti (Sonnante et al. 2002, 2003a, 2004b).
Tuttavia, l’utilizzo di marcatori AFLP ha permesso di ottenere un numero molto più elevato di marcatori polimorfici. L’analisi con 9 combinazioni di primer è stata estesa a 39 campioni di carciofo coltivato della collezione, un cardo coltivato, due cardi selvatici e tre specie selvatiche diverse di Cynara: C. humilis, C. cornigera e C. syriaca. In totale sono stati individuati 758 picchi, di cui 98 erano presenti soltanto nel carciofo coltivato, mentre 146 erano presenti soltanto negli altri taxa. Nel carciofo coltivato, 83.8% (513) del numero totale dei frammenti AFLP è risultato polimorfico. L’analisi cluster ha permesso di raggruppare le varietà di carciofo in gruppi che in genere corrispondono, salvo alcune eccezioni, ai raggruppamenti individuati su base morfo-fisiologica (Fig. 1). Possono essere individuati marcatori specifici per i diversi gruppi di carciofo, i tipi “Romaneschi”, tuttavia, hanno mostrato una maggiore variabilità. Questo gruppo di carciofi è considerato il più evoluto (capolino non spinoso, grosso) e per questo motivo potrebbe aver subito una maggiore pressione selettiva, producendo una variabilità più elevata (Sonnante et al. 2003b, 2004a).
Un’ulteriore analisi ha riguardato lo studio del “Carciofo di Mola” di tipo “Catanese”. Questa varietà è tradizionalmente coltivata nella zona di Mola di Bari, anche se negli ultimi anni si sta assistendo ad un suo progressivo abbandono, in favore soprattutto del “Violetto di Provenza”, principalmente a causa di problemi fito-sanitari. Un’indagine tra gli agricoltori ha dimostrato che nonostante tutto, il “Carciofo di Mola” viene spesso preferito ad altre varietà anche grazie alle sue caratteristiche organolettiche e perciò alcuni agricoltori continuano a coltivarlo nella provincia barese, adattando l’agrotecnica all’esigenza di limitare i danni fitopatologici.
Per stimare il livello di variabilità presente in questa varietà locale, anche al fine della sua tipizzazione e valorizzazione, sono stati raccolti genotipi di 3 popolazioni di “Carciofo di Mola” che sono stati confrontati tramite analisi AFLP con 3 popolazioni di tipo “Brindisino” raccolte anch’esse in campo e 4 di tipo “Catanese”, di origine siciliana, presenti nella collezione vivente dell’Istituto.
Sono state utilizzate tre combinazioni di primer che si erano già dimostrati altamente polimorfici in carciofo. I risultati ottenuti dall’analisi di similarità, basata sui 162 frammenti AFLP prodotti, mostrano che i genotipi Locale di Mola e Brindisini si presentano come gruppi abbastanza omogenei, mentre, i Catanesi di origine siciliana tendono ad essere più variabili lasciando supporre che i tipi Catanesi siciliani hanno dato origine a quelli pugliesi e che la riduzione di variabilità è probabilmente dovuta all’adattamento al nuovo areale.



2. U.O. DIPARTIMENTO DI PRODUZIONE VEGETALE, UNIVERSITÀ DELLA TUSCIA,VITERBO

Titolo della ricerca:
Caratterizzazione nutrizionale, terapeutica, molecolare ed agronomica di cloni di carciofo “Romanesco” . (Responsabile: Prof. Francesco Saccardo)

L’U.O. di Viterbo con varietà di carciofo a produzione primaverile ha avviato un campo catalogo presso l’azienda dimostrativa ARSIAL di Tarquinia ed ha selezionato alcuni cloni di interesse. Su di essi è stata eseguita una valutazione morfo-fisiologica in collaborazione con l’U. O.dell’ENEA alla quale si rimanda per la visualizzazione dei risultati conseguiti.
Allo scopo di valutare la variabilità genetica si sono individuate 3 aziende in provincia di Latina e 1 a Cerveteri che coltivano landraces di Romanesco e in esse si sono collezionati 30 genotipi per azienda. Per il fingerprinting molecolare su tutti i genotipi si è proceduto all’estrazione del DNA (protocollo CTAB modificato). Studi preliminari con primers decameri commerciali delle serie OPA e OPB della Operon Technologies hanno indicato la scarsa utilità dei marcatori RAPDs per l’identificazione univoca di cloni di carciofo di varietà primaverili. Sono quindi stati impiegati marcatori molecolari AFLP e ISSR (Cardarelli et al., 2004). La matrice ottenuta è stata utilizzata nella sua totalità, considerando solo i marcatori AFLP e solo gli ISSR per le analisi statistiche, applicando il software GDA (Lewis e Zaykin, 1996). Si è ottenuta la stima della variabilità genetica fra ed entro popolazioni, il livello di eterozigosità attesa e le distanze genetiche (Nei, 1972) fra le popolazioni da cui poi si sono ottenuti i dendrogrammi di similarità genetica usando la metodologia UPGMA. I risultati hanno mostrato la presenza di una elevata percentuale di variabilità all'interno di ogni popolazione (71-78% del totale) e tra piante di aziende diverse (22 e il 29% del totale. La percentuale di loci polimorfici è risultata pari all’80% per gli AFLP, all'83% per gli ISSR e all’81% per entrambi i marcatori insieme. Le differenze di polimorfismo rilevate analizzando le singole aziende dipendono dal fatto che i due tipi di marcatore rivelano differenti regioni genomiche con diverse similarità e differenze tra i genotipi considerati. L’eterozigosità attesa (He), indicatrice della frequenza dei singoli alleli, evidenzia che l'elevato polimorfismo è determinato da loci che in media hanno l’allele più rappresentativo presente con una frequenza di circa l’80% e l’allele più “raro” con frequenza del 20%; pertanto la variabilità presente all'interno delle popolazioni è rilevante. I dendrogrammi ottenuti utilizzando le matrici delle distanze genetiche di Nei (1972) hanno rilevato distanze genetiche tra le popolazioni non molto alte per la maggior variabilità all'interno delle popolazioni che non fra popolazioni. Anche se le popolazioni 'Latina 1' e 'Cerveteri' risultano sempre più distanti, nei casi in cui si utilizzano solo i marcatori AFLP o tutti e due i tipi di marcatori le tre popolazioni provenienti dalla provincia di Latina si raggruppano più vicine mentre quella di Cerveteri è più distante; nel caso invece in cui si considerano solo i marcatori di tipo ISSR la popolazione di Cerveteri si colloca del primo raggruppamento vicino a quella 'Latina 3'. La caratterizzazione molecolare ha così mostrato l'esistenza di una grande variabilità all'interno delle aziende analizzate che ancora utilizzano ecotipi locali, rilevando la presenza di un buon germoplasma da porre in conservazione.
L’analisi dei contenuti di acido clorogenico eseguita  in collaborazione con l’Università di Pisa su Grato 1, Grato 2,  Castellammare, C3, Locale di Mola, Violetto di Sicilia  hanno evidenziato  che Grato 1, Grato 2,  Castellammare e C3 possiedono rilevante qualità nutrizionale con valori, rispettivamente, di 2,02 , 1,23, 1,33 e 1,68 di AC mg /g peso fresco rispetto a Locale di Mola (0,63) e Violetto di Sicilia (0,80).



3. U.O. UTS Biotecnologie, Protezione della Salute e degli Ecosistemi, Roma

Titolo della ricerca:
Isolamento, caratterizzazione e propagazione in vitro di cloni di carciofo di cvs primaverili. (Responsabile: Dr.ssa Raffaela Tavazza)

Nel carciofo “Romanesco” lo sviluppo di tecniche di propagazione in vitro ha generato un restringimento della variabilità genetica esistente a causa della preferenza data dagli agricoltori ad un singolo clone (C3) di carciofo, caratterizzato da elevatà precocità.
L’U.O. dell’ENEA si è proposto di recuperare e caratterizzare ecotipi di carciofo “Romanesco” che rischiavano di andare perduti in conseguenza della diffusione di del clone C3 proveniente da micropropagazione.
A tal fine, sono stati individuati questi campi residui in cui erano presenti ecotipi non provenienti da micropropagazione da cui è stato prelevato materiale per l’avvio della moltiplicazione in vitro e la produzione di piantine da utilizzare per la successiva caratterizzazione morfofisiologica e produttiva. In totale sono stati isolati apici vegetativi da circa 40 piante in diversi campi che sono stati trasferiti in vitro.
Nel primo anno di attività del progetto sono state definite procedure ottimali per le diverse fasi: di moltiplicazione in vitro, di radicazione e trasferimento in campo. In particolare, è stato messo a punto un terreno di coltura, con un differente rapporto ammonio/nitrato rispetto al terreno MS, che ha consentito di ottenere un buon livello di proliferazione associato ad una buona qualità dei germogli prodotti.
Piantine di 23 cloni moltiplicate in vitro e trasferite in un campo sperimentale dell’ARSIAL a Tarquinia  sono state utilizzate per la caratterizzazione e valutazione agronomica.
I vari cloni hanno mostrato una notevole scalarità nell'entrata in produzione che ha permesso l'individuazione di cloni precoci, che hanno maturato il carciofo “cimarolo” in tempi simili al controllo (C3), per definizione precoce, e di cloni tardivi, che sono entrati in produzione anche 35 giorni dopo.
Diametro ed altezza delle piante sono state rilevate in concomitanza alla raccolta del cimarolo.  L’ analisi delle dimensioni della pianta e del capolino principale hanno evidenziato come  l'altezza della pianta sia una caratteristica discriminante la precocità o meno del clone in esame. In generale, si è rilevato che i cloni precoci risultano di taglia inferiore a quelli tardivi. Inoltre, le piante precoci hanno maturato capolini principali e secondari di pezzatura più piccola rispetto ai tardivi, mentre sono stati individuati cloni con buona produzione totale (in peso) per il mercato fresco sia tra i precoci, che tra i tardivi.
Per quanto concerne il numero dei capolini prodotti per pianta, un indice di produttività importante dal punto di vista economico, alcuni cloni precoci risultano avere un numero di capolini significativamente maggiore del clone C3. I cloni tardivi, invece, risultano avere un numero di capolini mediamente più basso dei precoci, caratteristica che viene in parte compensata dalla maggior pezzatura dei capolini stessi.
In conclusione, sono stati isolatti e caratterizzati 23 genotipi di carciofo che presentano differenze statisticamente significative per molti dei caratteri quantitativi. I cloni isolati, con la loro scalarità di produzione, potranno essere vantaggiosamente utilizzati dai cinaricoltori, che potrebbero contare su una maggior protezione della produzione totale da eventuali gelate, una ottimizzazione dell'impiego delle risorse umane e la possibilità di migliorare l' offerta sul mercato. 
Il materiale in collezione selezionato è stato  messo a disposizione di altre unità operative per la caratterizzazione molecolare e delle caratteristiche salutistiche dei cloni e verrà nuovamente valutato il prossimo anno per la conferma dei risultati.



Linea di attività  “FAGIOLO”

A questa Linea di attività hanno partecipato le 5 UU.OO. di seguito riportate:

1. U.O. DIPARTIMENTO DI AGROBIOLOGIA E AGROCHIMICA, UNIVERSITÀ DELLA TUSCIA, VITERBO  (Responsabile Prof. Oronzo Antonio TANZARELLA )

Titolo della ricerca:
Identificazione e valorizzazione delle risorse genetiche autoctone di Phaseolus coccineus

 La ricerca svolta ha riguardato la messa a punto e l’applicazione di marcatori biochimici e molecolari per lo studio della variabilità esistente in germoplasma autoctono italiano di Phaseolus coccineus, o fagiolo di Spagna.
Durante il primo anno è stato reperito il materiale vegetale, consistente di accessioni custodite in collezioni di germoplasma e di alcune accessioni ottenute direttamente da agricoltori dell’Italia centrale. Le 54 accessioni provenivano da 11 diverse regioni italiane. Sono state acquisite, inoltre, accessioni provenienti dall’America centrale e meridionale, centro di origine del P. coccineus, come termine di confronto della variabilità esistente nel germoplasma italiano.
E’ stata effettuata l’analisi elettroforetica SDS-PAGE delle proteine del seme di 10 genotipi per ciascuna di 26 accessioni italiane, per un totale di 260 genotipi analizzati, rilevando un’ampia variabilità, sia entro sia tra accessioni, per la composizione proteica. Sono stati identificati, in particolare, alcuni genotipi nei quali erano pressoché assenti le frazioni relative a fasoline e lectine. Questi materiali potrebbero essere molto interessanti per il miglioramento delle caratteristiche nutrizionali del P. coccineus.
E’ stata eseguita, inoltre, l’analisi preliminare di una serie di marcatori molecolari utilizzando 12 genotipi italiani e 9 americani provenienti da altrettante accessioni. Sono stati analizzati, in particolare, 10 RAPD, 7 ISSR, 6 IT/ET, 7 IRAP/REMAP e 6 combinazioni AFLP. Per le analisi successive sono stati selezionati sette marcatori.
Durante il secondo anno di attività i sette marcatori selezionati (3 RAPD, 2 ISSR e 2 ET) sono stati usati per analizzare cinque genotipi per ciascuna di 22 accessioni italiane e 4 americane, per un totale di 130 genotipi analizzati. In totale sono stati rilevati 83 loci, intesi come presenza/assenza dei prodotti di amplificazione. Il calcolo di una serie di indici del potenziale discriminante dei tre tipi di marcatori utilizzati ha dimostrato la maggiore efficacia degli ISSR. L’analisi cluster effettuata con l’insieme dei dati ottenuti ha permesso di raggruppare correttamente gran parte delle accessioni italiane e americane, con le uniche eccezioni rappresentate dai cinque genotipi di un’accessione di provenienza calabrese e da un genotipo di un’accessione abruzzese, che erano raggruppati con le accessioni americane. Il dendrogramma ottenuto con l’analisi cluster, inoltre, ha incluso correttamente in uno stesso cluster i cinque genotipi di gran parte delle accessioni analizzate. Risultavano particolarmente dispersi lungo il dendrogramma, invece, i genotipi di due accessioni raccolte direttamente dagli agricoltori. L’analisi AMOVA ha permesso di ripartire la varianza nelle componenti tra ed entro accessioni, dimostrando la netta prevalenza di quest’ultima componente. Tale risultato è compatibile con il sistema riproduttivo del P. coccineus, prevalentemente allogamo. I sette marcatori utilizzati sono stati in grado di distinguere la quasi totalità dei genotipi analizzati, anche appartenenti alla stessa accessione. Solo due coppie di genotipi, verosimilmente identici, presentavano gli stessi profili con tutti i marcatori.
I risultati più interessanti scaturiti dalla ricerca sono: l’identificazione di una serie di genotipi che presentano profili proteici peculiari, potenzialmente utili per il miglioramento della qualità nutrizionale della granella; la messa a punto di sette marcatori molecolari in grado di identificare univocamente genotipi anche molto simili e quindi utili per il fingerprinting; l’osservazione che nei materiali coltivati dagli agricoltori è ancora presente un’ampia variabilità genetica e, quindi, l’opportunità di procedere alla loro raccolta, conservazione, catalogazione e caratterizzazione.



2. U.O. Dip. Biologia Difesa e Biotecnologie Agro-forestali Università degli Studi della Basilicata (Responsabile Prof. Pierluigi Spagnoletti Zeuli)

Titolo della ricerca: Identificazione e valorizzazione di risorse genetiche di fagiolo comune dei bacini idrografici del Mezzogiorno d’Italia per un’agricoltura sostenibile.

In una collezione di 623 accessioni di fagiolo raccolte nei quattro bacini idrografici della Basilicata (Agri, Melandro, Mercure e Sinni) sono stati misurati 10 caratteri morfo-agronomici e sono stati analizzati i polimorfismi delle faseoline (oltre il 70% hanno un tipo ‘C ‘Contender’, > 25% pattern di tipo T ‘Tendergreen’ e < 3% pattern di tipo S ‘Sanilac’). L’analisi canonica discriminante, condotta sulle singole accessioni, ha permesso di individuare 29 diverse landraces. Considerando la numerosità delle accessioni raccolte, la loro distribuzione sul territorio, i dati biochimici e quelli morfo-agronomici sono state identificate tre landraces eterogenee: due con IGP ‘Fagioli di Sarconi’ (PZ) a diverso habitus di crescita (Marrozzo rappresentata da 43 accessioni tipo, rampicante, e Verdolino con 21 accessioni, ad habitus determinato) ed una con proposta di IGP ‘Fagiolo di Rotonda’ (Poverella con 22 accessioni tipo, ad habitus indeterminato). Per ciascuna delle due landraces “Marrozzo” e “Verdolino” è stato ottenuto un lotto di semi che è stato allevato per più anni consecutivi in due ambienti diversi: in Villa D’Agri, territorio dell’IGP Sarconi, e Senise nella valle del Sinni. Gli effetti dell’allevamento sulla struttura genetica di ciascun lotto, utilizzato per la produzione di seme, sono stati studiati dal 2002 al 2004 utilizzando 19 caratteri morfo-fisiologici (50 piante x 3 repliche x 2 ambienti x anni) e marcatori genetici (6 coppie di primer SSR usati in multiplex e 2 combinazioni AFLP x 60 piante x anno x 2 ambienti x anni). I risultati ottenuti hanno dimostrato che l’ambiente e gli anni di allevamento influenzano significativamente medie e frequenze dei caratteri morfo-fisiologici osservati.
Nel primo anno di moltiplicazione (2002) nella popolazione Marrozzo erano presenti 22 alleli su 6 loci polimorfici SSR (no =3,67) che dopo due anni di moltiplicazione erano diventati 19 (no =3,17) nell’ambiente di Villa D’Agri e 20 (no =3,33) in quello di Senise. La frequenza di alcuni alleli è cresciuta: l’allele 129bp del locus SSR1 è passato da 0.53 a 0.78 a Villa D’Agri e da 0.53 a 0.83 a Senise, l’allele 220bp del locus SSR5 è passato da 0.11 a 0.26 a Villa D’Agri e l’allele 220bp dello stesso locus è aumentato passando da 0.07 a 0.30 a Senise, per altri la frequenza è diminuita (il locus 135bp del microsatellite SSR6 è diminuito passando da 0.85 a 0.60 a Villa D’Agri e da 0.85 a 0.80 a Senise) ma nessun locus si è fissato. Nel primo anno di moltiplicazione (2000) la popolazione Verdolino aveva in totale 12 alleli (no =2,0) che si sono ridotti a 8 (no =1,5) dopo cinque anni di moltiplicazione nell’ambiente di Villa D’Agri ed a 10 in quello di Senise (no =1,67). La percentuale di polimorfismo è diminuita passando dal 66,7% al 50% in entrambi gli ambienti. La struttura della popolazione Verdolino è risultata più stabile in entrambi gli ambienti di moltiplicazione, anche se a Villa D’Agri è stata monitorata per un arco di tempo più lungo (2000-2004). In soli tre anni di moltiplicazione due alleli hanno raggiunto la fissazione in entrambi gli ambienti (allele 129bp del locus SSR1 ed allele 160bp del locus SSR16). Come atteso, in entrambe le popolazioni si è assistito alla scomparsa di alleli rari (p< 0.05). Sono comparsi anche due “nuovi” alleli: uno in Marrozzo (160bp per il locus SSR16 a Senise) ed uno in Verdolino (160bp per il locus SSR17 a Senise). Per entrambe le combinazioni AFLP (E-AGT x M-GTA ed E-AGT x M-GAC) la frequenza relativa di ciascuna banda è variata sia negli anni sia per entrambi gli ambienti. Nel primo anno di moltiplicazione la popolazione Marrozzo ha mostrato una percentuale di polimorfismo del 100% per E-AGT x M-GTA e dell’87,9% per E-AGT x M-GAC. Per entrambe le combinazioni e gli ambienti di allevamento si è ridotta la percentuale di polimorfismo, rispettivamente 97.4% e 79.3%. Anche in Verdolino la combinazione E-AGT x M-GTA utilizzata ha mostrato una riduzione della percentuale di polimorfismo negli anni e per entrambi gli ambienti passando dal 96,2% al 69,8% a Villa D’Agri e al 71,7% a Senise. Entrambe le popolazioni sono facilmente distinguibili e geneticamente eterogenee ma l’allevamento ne ha modificato la loro struttura genetica. Poiché in conseguenza del successo commerciale del marchio IGP ‘Fagioli di Sarconi’ saranno ampliate le coltivazioni, sarà necessario anche aumentare la produzione del seme. La procedura di produzione del seme di ciascuna popolazione locale dovrà prevedere: 1. allevamento in purezza di un definito numero di progenie per ciascuna accessione disponibile; 2. costituzione di un lotto di seme utilizzando ugual numero di semi da ciascuna progenie; 3. moltiplicazione per n cicli  (max 3)  per ottenere il seme commerciale. Nel tempo sarà necessario valutare periodicamente la struttura genetica della popolazione per evitare i sempre possibili rischi di erosione genetica ed allo stesso tempo garantire la qualità del prodotto per i consumatori.



3. U.O. Università degli Studi di Perugia, Dipartimento di Biologia Vegetale e Biotecnologie Agroambientali (Responsabile Prof. Fabio Veronesi)

Titolo della ricerca: Individuazione e caratterizzazione di popolazioni autoctone di fagiolo e pomodoro nel centro Italia

Nel corso dei due anni di attività del progetto in stretta collaborazione con l’ UO di Potenza (Prof. Spagnoletti Zeuli), sono state studiate 18 accessioni di fagiolo (Phaseolus vulgaris L.) (rappresentative di 7 differenti tipologie locali) per l’identificazione di tratti morfologici e genetici distintivi dei materiali oggetto di studio.  Le accessioni sono state allevate in campo e caratterizzate, per aspetti vegetativi e riproduttivi, utilizzando i descrittori morfologici internazionali di maggior interesse. Successivamente, dalle stesse piante si è provveduto ad estrarre il DNA e l’intero gruppo di accessioni è stato analizzato con marcatori molecolari SSR (Simple Sequence Repeats), scelti in base alla loro capacità di evidenziare polimorfismo fra cultivar diverse, alla loro distribuzione sul genoma e a precedenti esperienze di questa UO. In particolare, in fagiolo, sono stati impiegati 10 marcatori.
In entrambe le specie studiate ciascuna accessione ha mostrato tratti morfologici e profili elettroforetici caratteristici che mostrano la loro peculiare identità. I dati ottenuti indicano che gli agricoltori hanno selezionato nel tempo varietà ben differenziate le une dalle altre e costituite da un insieme di genotipi differenti. Essi evidenziano inoltre come il livello di diversità fra ed entro le varietà locali analizzate sia di entità sostanzialmente maggiore a quanto comunemente pensato.
Nel complesso i risultati raccolti: a) evidenziano l’estrema diversità del patrimonio di varietà locali del centro Italia; b) confermano i marcatori molecolari come efficace mezzo di indagine della diversità genetica; c) pongono le basi scientifiche per stabilire la distinguibilità e l’unicità delle varietà locali oggetto di studio; d) possono essere un concreto ausilio nell’accesso a misure di sostegno alla conservazione delle risorse genetiche autoctone, e) possono essere utili agli enti preposti alla tutela delle risorse genetiche locali per pianificare azioni di conservazione on farm, le uniche ad essere adeguate ed efficaci per la salvaguardia della diversità genetica di interesse agrario.



4. U.O.: Istituto per le Biosintesi Vegetali in piante di interesse agrario (IBV), CNR (Responsabile Dr. Diego Breviario)

Titolo della ricerca: Carte di identità genetico-molecolare a tutela della tipicità dei prodotti agricoli e di nicchia

L’U.O. ha validato su fagiolo un metodo nuovo ed originale di determinazione di polimorfismi genetici nelle piante basato sull’utilizzo del primo introne presente nella sequenza codificante delle beta-tubuline di piante. I risultati sono riproducibili, rapidi ad ottenersi, di facile lettura, specifici per ecotipi, capaci di ricostruire l’origine geografica e  la derivazione genetica delle varietà.
Il metodo originale è stato ampliato con l’aggiunta del secondo introne come ulteriore fonte di polimorfismo del DNA. Questa integrazione del metodo originale amplia il numero delle bande polimorfiche ottenibili consentendo un’affidabile analisi filogenetica e di valutazione della variabilità inter e intravarietale. La combinazione dei dati di polimorfismo ottenibili sul primo e secondo introne consente la costruzione di matrici numeriche, trasformabili in altrettanti codici numerici che diventano specifici per la varietà analizzata. In questo modo sono stati ricostruiti profili genetici distintivi di tre su tre varietà locali di fagiolo provenienti dalla Basilicata (Marrozzo, Poverella e Verdolino). In una di questa è stato possibile identificare un polimorfismo intravarietale (Verdolino). Utilizzando il TBP integrato con primo e secondo introne si è ricostruito il quadro di derivazione genetica di varietà di fagiolo che hanno introgredito la mutazione fitoemoagglutinina meno sul backgroung genetico di una specie di importanza commerciale (Taylor). L’utilizzo del TBP ha portato a ricostruire in modo attendibile, considerate anche le diverse provenienze geografiche, la distanza filogenetica tra varietà Italiane  e mesoamericane.



5. U.O. : Istituto di Genetica del CNR, Sez. di Bari (Responsabile Dr. Gaetano Laghetti)

Titolo della ricerca: "Identificazione e valorizzazione di agro-ecotipi di fagiolo fresco italiani"

 La presente ricerca si prefiggeva la salvaguardia, la valutazione qualitativa e la valorizzazione di un segmento della collezione di agro-ecotipi autoctoni italiani di fagiolo (Phaseolus vulgaris L.). Inoltre, in collaborazione con l’unità operativa del Prof. P.L. Spagnoletti Zeuli dell’Università della Basilicata, era previsto uno studio dell’interazione Genotipo x Ambiente (GxA) relativo ad alcuni parametri qualitativi della granella.
E’ stata creata una banca dati computerizzata disponibile su CD-ROM. Nella banca dati è possibile trovare informazioni sui nomi locali, origine, etno-botanica, status genetico, disponibilità del materiale, eventuali dati di caratterizzazione e notizie varie. Ad oggi la banca dati contiene ca. 500 varietà locali di fagiolo e ‘garden forms’, tutte coltivate in Italia. Le regioni più ricche di agroecotipi di fagiolo sono: Friuli Venezia Giulia, Toscana, Piemonte, Basilicata e Liguria.
Si è realizzato il ringiovanimento, la moltiplicazione e la caratterizzazione morfo-agronomica di un segmento (103 accessioni) della collezione di germoplasma di fagiolo. Su tutto il germoplasma in prova si sono registrati 24 descrittori morfo-agronomici
. In ordine di importanza i parametri che discriminavano i principali gruppi di accessioni sono stati: abito di crescita, origine, colore del fiore e peso dei 100 semi. Questo studio indica inoltre che: a) le accessioni nell’ambito delle singole regioni italiane sono molto eterogenee tra esse; b) non sempre in regioni confinanti si coltivano varietà di fagiolo geneticamente simili; c) le varietà straniere più recenti ben si distinguono morfo-agronomicamente dagli antichi agro-ecotipi tipici delle nostre regioni.
Su 14 accessioni si è condotta una caratterizzazione chimico-nutrizionale (tipologia delle faseoline, contenuto proteico, in inibitori della tripsina e in ceneri). I valori degli inibitori della tripsina sono risultati relativamente bassi. Questo parametro è risultato, correlato negativamente con il contenuto proteico. Questo stesso materiale è stato analizzato, utilizzando alcuni marcatori molecolari (SSR e AFLP) dall’UO di Potenza. La varietà locale con il più elevato contenuto proteico è stata la “Lamon Bilò” (30%) mentre la “Zolfino 2” (21,5%) fece registrare il valore più basso. Il contenuto in ceneri è oscillato tra il 7% e il 4% e non è risultato significamente correlato con gli altri parametri biochimici. Le accessioni studiate erano caratterizzate dai pattern faseolinici ‘S’ (indicante l’origine centro-americana), ‘T’ (origine andina) e ‘C’, con nessuna variabilità entro accessione.
Tre specifici agro-ecotipi di origine lucana (“Poverella bianca”, “A’ Marozzo” e “Borlotto”) sono stati utilizzati nello studio dell’interazione GxA mediante un confronto in due località della Basilicata con diverso ambiente pedoclimatico. Gli agro-ecotipi hanno mostrato differenze statisticamente significative per il contenuto proteico e per quello in inibitori della tripsina, mentre per il contenuto in ceneri non si sono riscontrate differenze. L’effetto della località è risultata significativa solo nel caso del contenuto in inibitori della tripsina. I risultati hanno inoltre evidenziato una significativa interazione GxA solo per il contenuto in inibitori della tripsina.



Linea di attività: “CILIEGIO”

1. U.O.: ISTITUTO PER LA VALORIZZAZIONE DEL LEGNO E DELLE SPECIE ARBOREE – (IVALSA), AREA DELLA RICERCA, SESTO FIORENTINO, FIRENZE

Titolo della ricerca: Caratterizzazione del germoplasma di ciliegio toscano e umbro (Responsabile Dr. Giancarlo Roselli )

Nei due anni del Progetto sono stati reperiti in Toscana e Umbria 162 ecotipi e cultivar di ciliegio delle due specie Prunus avium e Prunus cerasus. I principali genotipi sono stati caratterizzati morfologicamente per caratteri dell’albero, della foglia, del fiore, del frutto e dell’endocarpo, secondo un descriptor list elaborato dall’istituto. In particolare per il frutto sono stati determinati i caratteri riguardanti il colore, definito da lucentezza e dalle due componenti rossa e gialla, la pezzatura (peso e calibro) e la consistenza del frutto (resistenza della buccia e della polpa). L’analisi chimica ha preso in considerazione l’acidità titolabile e gli acidi organici malico e tartarico, il Residuo Secco Rifrattometrico e gli zuccheri (glucosio, fruttosio, sorbitolo). Ha fatto seguito l’analisi sensoriale dei frutti (panel test composto da 20 giudici), che ha definito con punteggi, la gradevolezza visiva, gustativa e strutturale e quindi la gradevolezza media complessiva dei frutti di ciascun genotipo. Le cultivar analizzate sono state riunite in gruppi di ottima gradevolezza (Marchiana 108, Capellino 67, Bella di Arezzo 70, Gavorgnana 71, Poponcina 43-42), buona gradevolezza (Turca 45-3, Papalona 60, Papale 83-2, Avorio 119,Turca 45-1), media gradevolezza (Durona di Misciano 41, Crognola 110, Napoletana 76, S. Giovanni 47). Lo studio delle correlazioni ha messo in evidenza, tra l’altro, un’alta correlazione tra la gradevolezza complessiva e l’aroma (r= 0,90). Dai risultati delle analisi si evince che alcune cultivar, con alto punteggio di gradevolezza totale, attualmente a rischio di estinzione, potrebbero essere vantaggiosamente inserite in prove agronomiche, per essere confrontate con le cultivar, spesso selezionate in paesi esteri, che talvolta non rispondono ai nostri ambienti. I principali genotipi reperiti e caratterizzati sono stati descritti in una monografia.
Tutti gli ecotipi e cultivar reperiti sono stati collocati in collezione presso l’Azienda Sperimentale dell’ IVaLSA, iscritti nel registro per la Tutela delle Risorse Genetiche della Toscana e inseriti nelle banche dati dell ARSIA e dell’IVaLSA, consultabili in internet (http://www.ivalsa.cnr.it ).
La caratterizzazione quali-quantitativa, effettuata via HPLC/DAD/MS ha permesso di evidenziare come i frutti delle cultivar di ciliegie dolci presentino uno stesso pattern antocianico costituito da sei antocianine, in prevalenza keracianina e cianidina 3-O-glucoside, con quantità decisamente inferiori di diglicosidi della peonidina. Sono stati individuati anche due diglicosidi della pelargonidina mai citati precedentemente in letteratura come costituenti delle ciliegie dolci. Il pattern antocianico delle ciliegie acide, così come osservato per le ciliegie dolci, è risultato assolutamente analogo fra le diverse cultivar analizzate con la cianidina 3-O-glucosil rutinoside come prodotto prevalente insieme alla keracianina. Anche in questi campioni sono inoltre presenti in tracce la peonidina 3-O-rutinoside e la cianidina 3-O-arabinosil glucoside. Le quantità totali di antociani, espresse in cianidina 3-O-rutinoside, variano da 0,01 a 5,21 mg/g di polpa fresca. I contenuti di 27 di campioni di ciliegie dolci oscillano tra 0,01 e 0,80 mg/g mentre solo nove campioni hanno un tenore piuttosto elevato, compreso tra 1,95 e 5,21 mg/g. Le altre cultivar presentano valori intermedi. Per quanto riguarda le cultivar di ciliegio acido sono stati individuati due gruppi distinti, il primo con valori compresi tra 0,12 e 0,25 mg/g , il secondo con valori compresi tra 1,01 e 1,59 mg/g.
E’ stato condotto anche uno screening sulle altre molecole fenoliche copresenti nel frutto; sono stati individuati come componenti principali un gruppo di acidi cinnamoil chinici e glicosidi rispettivamente della quercetina e del canferolo. Dai risultati ottenuti si può prospettare la valorizzazione di alcuni genotipi, decisamente molto ricchi in antocianosidi, molecole note per le loro proprietà antinfiammatorie e antiossidanti, sia per il consumo fresco che per un potenziale utilizzo nel settore dei food supplements, area attualmente in forte espansione.
Per quanto riguarda la propagazione in vitro, condotta su quattro cultivar, sono state utilizzate gemme isolate da talee semilegnose, prelevate in estate. Il substrato nutritivo che si è rivelato più idoneo per la stabilizzazione delle culture è risultato composto da MS, addizionato di 20gr/l di saccarosio, 7 gr/l di Difco-Bacto agar e 5 microM di BA. Sono state anche effettuate varie prove preliminari di crioconservazione, dalle quali  è scaturito che la precoltura delle gemme per 2 giorni a 4°C, su substrato MS + saccarosio 1M, seguita da trattamento con PVS2 a 25°C per 60’ consente la migliore conservazione del materiale. Infatti, dopo immersione diretta in azoto liquido, scongelamento e piastratura, è stato possibile pervenire a percentuali di ricrescita, per i due genotipi saggiati, rispettivamente del 50 e dell’85%.




2. U.O.: CNR-Istituto di Ricerche sul Miglioramento Genetico delle Piante Foraggere (Responsabile Dr. Sergio Arcioni)

Titolo della ricerca: Riconoscimento varietale in ciliegio mediante marcatori molecolari

La UO CNR-IGV di Perugia si è occupata della caratterizzazione molecolare di alcune cultivar di Prunus avium campionate in Italia Centrale. Il lavoro svolto ha riguardato il fingerprinting tramite marcatori molecolari basati su sequenze ripetute. I marcatori molecolari adoperati sono stati gli ISSR e due nuovi sistemi i REMAP ed i MIMAP sviluppati per la prima volta in ciliegio. Il REMAP è un marcatore molecolare basato sulla sequenza LTR di un retrotransposone Ty/copia clonato in ciliegio nell’ambito del progetto, mentre il MIMAP è basato su di un minisatellite di ciliegio già noto. Entrambi i sistemi sono basati sull’amplificazione di DNA genomico con un primer specifico per la sequenza ripetuta ed un primer ISSR. Il confronto dell’efficienza dei vari tipi di marcatori molecolari è stata ottenuta applicando l’indice Dith di Tessier (1999) ed ha mostrato che gli ISSR consentono di ottenere il più alto potere di discriminazione delle cultivars.
Sulla base dei dati molecolari raccolti con ciascun tipo di marcatore molecolare sono stati costruiti dei dendrogrammi di similarità. Appositi tests statistici hanno dimostrato la robustezza dei dendrogrammi ed un significativo grado di correlazione tra di essi. Ciascuno dei dendrogrammi presenta due cluster principali: il primo contenente cultivars con frutto duracino (tipo bigarreau) ed il secondo contenete cultivars prevalentemente a frutto tenero (cultivars gean). All’interno dei sottogruppi erano ben visibili clusters contenenti cultivars con caratteristiche fenotipiche simili come ad esempio il colore della buccia o la lunghezza del peduncolo. 
Per quanto riguarda l’associazione di marcatori molecolari a caratteristiche fenotipiche utili, non disponendo di opportune  popolazioni segreganti  si è deciso di verificare la fattibilità di approcci basati sul mappaggio di associazione. L’analisi della struttura genetica della collezione, condotta con 27 loci SSR, ha rivelato un gran numero di loci con un significativo deficit di eterozigoti. Con appositi tests statistici si è appurato che la causa più plausibile per spiegare una tale situazione era l’effetto di Whalund, essendo l’inincrocio e la presenza di alleli nulli meno probabili.
Poichè le informazioni sui pedigree e sulle provenienze erano frammentarie e/o poco attendibili, si è deciso di tentare la destrutturazione della collezione utilizzando dei modelli genetici. L’applicazione di un approccio che ripartisce gli individui tra le sottopopolazioni in maniera da massimizzare l’equilibrio Hardy Weinberged, il linkage equilibrio genotipico, ha portato all’individuazione di due sottopopolazioni. che sono ora disponibili per approcci basati sul mappaggio di associazionie con geni/marcatori candidati.



Linea di attività “AGRUMI”

1. U.O.: CNR-Istituto di Ricerca per la Genetica degli Agrumi ( Responsabile Dr. Nicasio Tusa)

Titolo della ricerca: Valorizzazione del germoplasma agrumicolo autoctono siciliano.

L’ U.O. aveva lo scopo prioritario di ampliare la disponibilita’ di germoplasma agrumicolo presente presso l’ azienda sperimentale di Lascari (Pa) e di valutare, mediante marcatori molecolari alcune collezioni di germoplasma di limone autoctono presenti in azienda, una collezione di ibridi intraspecifici di limone,  ottenuti da incroci tra i cibridi di limone Femminello per un clone di  limone tollerante al malsecco, ed infine una raccolta di cloni di Arancio amaro, prelevati dai diversi areali siciliani e da raccolte effettuate da altre istituzioni scientifiche.
Inoltre, in stretta collaborazione con l’U.O  dell’ENEA si è analizzato il livello di ploidia degli individui ottenuti per incroci interploidi tra il limone Femminello ed ibridi somatici simmetrici e asimmetrici.
Infine, è stato eseguito uno studio sul contenuto in oli essenziali degli agrumi minori (chinotto e bergamotto) e di alcuni ibridi triploidi di limone.
Per quanto riguarda il primo punto, si è implementata la nostra collezione agrumicola, con particolare riferimento alle cosiddette varietà neglette e agrumi minori (chinotto e bergamotto) in forte pericolo di estinzione e si è  provveduto ad effettuare le raccolte dirette di germoplasma presso aree vocate per reperire rari materiali selezionati direttamente dai coltivatori nel corso degli anni.
Per quanto riguarda la scelta  dei marcatori molecolari più appropriati nel mettere in evidenza i polimorfismi nella collezione del germoplasma autoctono siciliano di limone ed arancio amaro, i migliori risultati sono stati raggiunti con l’utilizzazione di ISSR-PCR e RAPD. I primer utilizati hanno consentito di discriminare 10 cloni di limone Femminello e 11 cloni di Arancio amaro.
Sulla discendenza ottenuta da incroci tra cibridi di limone Femminello (2C e 4C) con un clone di diploide  di Femminello,  i risultati migliori sono stati ottenuti con l’analisi dei microsatelliti (SSRs) e con la tecnica degli AFLP, modificata per l’utilizzazione di una sola sequenza adattatrice e la rilevazione delle bande amplificate su semplice gel di agarosio e bromuro di etidio. Con l’applicazione di queste tecniche su un totale di 20 piante analizzati sono stati individuati 12 piante zigotiche di cui 6 diploidi e 6 triploidi.
Sugli ibridi ottenuti per incrocio tra un clone di Femminello e due diversi ibridi somatici allotetraploidi (Milam + Femminello e Key lime + Valencia) in collaborazione con l’U.O. dell’ENEA, è stata effettuata l’analisi citofluorimetrica, che ha permesso di individuare 59 ibridi Femminello x (Milam + Femminello) e 20 ibridi di Femminello x (Key lime + Valencia).
È stato inoltre effettuato uno studio degli oli essenziali negli  ibridi triploidi, e precisamente Femminello x (Valencia + Femminello) e Femminello x (Key lime + Valencia), che ha messo in evidenza una marcata variabilità nei profili terpenici degli oli essenziali degli ibridi esaminati  lacui conoscenza consentirà di definire un programma di miglioramento genetico per la selezione di chemotipi di interesse per l’industria agroalimentare e profumiera.



2. U.O.: UTS Biotecnologie, Protezione della Salute e degli Ecosistemi, Roma (Responsabile Dr. Sergio Lucretti)

Titolo della ricerca: “Valorizzazione Agrumi Italiani “

Le principali attività di ricerca dell’U.O. ENEA sono state finalizzate allo sviluppo di metodologie genomiche e citogenomiche per l’analisi della costituzione del genetica dei Citrus, la determinazione varietale, l’assistenza al "breeding" tradizionale per velocizzarlo, la valutazione della biodiversità, con il fine ultimo della valorizzazione delle risorse genetiche agrumicole locali. Le attività sono state condotte in collegamento con l’ Istituto di Genetica Vegetale del CNR, Sez. di Palermo, che ha fornito il germoplasma utilizzato per la sperimentazione.
Il Progetto ha affrontato la problematica della definizione della costituzione genomica nei Citrus utilizzando diversi approcci tecnico-metodologici, sia molecolari che citogenetici e cellulari.
L’approccio citogenetico ha consentito di valutare la ploidia di piu’ di 400 linee provenienti sia da reincroci tra varietà e ibridi somatici che da varietà e portainnesti di pregio per l’agrumicoltura italiana, identificando 9 linee tetraploidi sia da ibridazione che da endopoliploidizzazione e 51 linee triploidi da reincrocio. Per conseguire questi risultati, sono state ottimizzate le procedure di isolamento nucleare in sospensione che consentono di ottenere valutazioni di ploidia da espianti di tessuto fogliare sino a quantità inferiori a 10mg.
Per indagare la struttura del genoma dei Citrus, al fine di costituire una mappa sia genomica che fisica della localizzazione genica, per l’isolamento di geni responsabili della sintesi di pigmenti antocianici, tipici delle arance a polpa rossa, è stata avviata la messa a punto di una procedura di manipolazione cellulare che implica l’uso di colture in vitro, citogenetica e citofluorimetria flusso per ottenere frazioni pure di singoli tipi cromosomici, identificabili in modelli teorici, per la costituzione di librerie a grandi inserti, materiale unico dalle quali isolare geni, sequenze regolatrici e complessi genici associati.
Inoltre, dopo aver ottimizzato le procedure di estrazione del DNA da tessuti ricchi in olii essenziali, sono state condotte attività di molecular profiling utilizzando diversi tipi di marcatori molecolari di tipo PCR, come RAPDs, AFLP a singolo enzima e ISSR, che hanno consentito di costruire “alberi filogenetici” derivati da matrici di dati di presenza/assenza di bande marcatrici e definire relazioni di somiglianza tra i diversi genotipi. Sulla base di queste informazioni, saranno definiti i nuovi programmi di ibridazione somatica, incrocio e reincrocio con lo scopo di massimizzare la variabilità genetica generabile.
Sono stati intrapresi studi sulla identificazione dei geni responsabili degli ultimi passaggi della biosintesi degli antociani. In particolare, l’attenzione si è rivolta verso gli ultimi tre geni strutturali della via che portano alla sintesi finale del pigmento cianidina 3 glucoside, ossia la DFR (Diidroflavonol reduttasi), la ANS (Antocianidin sintasi) e la UFGT o GlyT (flavonoid glucosiltransferasi). Si è avviata la costituzione di una libreria a cDNA organo-specifica da vescicole isolate dalla polpa di Citrus sinensis Tarocco dalle quali è stato estratto l’RNA trascritto in cDNA via RT-PCR. Tramite ibridazione con sonde molecolari derivate dall’analisi di sequenza di geni omologhi da altre specie vegetali presenti in banca dati in rete, è stato possibile isolare un frammento di 617bp, lunghezza leggermente superiore all’atteso per la presenza di un introne. I prodotti di amplificazione, visibili come una singola banda sul gel, sono stati clonati nel vettore pZEr0 e dall’analisi dei cloni, sia per elettroforesi su gel che per sequenziamento, si è ottenuta la sequenza consenso che sottoposta all’analisi BLAST ha dato una elevata omologia con le sequenze di ANS delle diverse specie.
Da questa sonda specifica per l’ANS si potra’ individuare il rispettivo gene nella libreria genomica in fase di costruzione. Cio’ consentira’ di utilizzare questo gene, isolato per la prima volta in Citrus, in esperimenti di espressione sia transiente che stabile per determinarne il ruolo ed aprire la strada alla chiarificazione di un fenomeno ancora oggi largamente incompreso quale quello della pigmentazione antocianica e dei fattori che ne regolano la presenza.



Linea di attività  : “NOCCIOLO”

1. U.O.: UTS Biotecnologie, Protezione della Salute e degli Ecosistemi, Roma (Responsabile Dr. ssa Loretta Bacchetta)

Titolo della ricerca: Utilizzo di metodi molecolari per la caratterizzazione di genotipi locali di nocciolo (Corylus avellana) selezionati per caratteri agronomici e merceologici.

Gli obiettivi dell’U.O. nel nocciolo erano rappresentati dall’analisi della variabilità genetica inter ed intravarietale e lo sviluppo di protocolli di micropropagazione. Di seguito sono riassunti i principali risultati ottenuti:
1. Caratterizzazione attraverso parametri morfo-biometrici e merceologici di 24 varietà italiane ed estere. Individuazione di un profilo elettroforetico distintivo, attraverso analisi del DNA col metodo RAPDS, per ciascuna delle maggiori varietà italiane (Tonda Romana, Nocchione, Tonda Bianca, Tonda Rossa, Tonda Giffoni, Tonda delle Langhe, Piazza Armerina) e turche (Tombul). Analisi filogenetiche sia col metodo UPGMA che Neighbor Joining, utilizzando diversi set dei dati ottenuti da RAPDS e da valutazioni morfo-biometriche.
2. Selezione clonale nella cv Tonda Romana ed individuazione di 5 genotipi scarsamente polloniferi, con precocità di maturazione, resistenza al freddo ed elevata % di pelabilità;   reperimento di varietà locali quali Tonda Rosa e Cappello di Prete. Indagine su nuovo materiale genetico autoctono in Sardegna (zona Belvì, Nuoro) e in Sicilia (fascia orientale Parco dell’Etna).
3. Sviluppo della metodologia AFLP: utilizzo di primers fluorescenti nell’amplificazione selettiva e la separazione dei frammenti ottenuti tramite sequenziatore automatico di DNA Applied Biosystems. Sono state effettuate analisi preliminari utilizzando diverse combinazioni di primers, che hanno permesso di individuare le condizioni ottimali per l’ottenimento di un significativo polimorfismo a livello varietale. I dati preliminari confermano quelli ottenuti con RAPDs.
4. Ottimizzazione della tecnica di micropropagazione a partire da materiali con diverse fasi fenologiche delle piante madri. Costituzione di una collezione di piante madri allevate in serra a partire da polloni raccolti in campo. I risultati ottenuti hanno mostrato che gli espianti uninodali prelevati in autunno hanno una migliore rispondenza alla propagazione in vitro se sottoposti ad un pretrattamento a 5°C per 21 giorni e se ripuliti dalla parte legnosa e dalle perule più esterne alla gemma. La citochinina più idonea in questa fase di prelievo è risultata il BAP ad una dose compresa tra 2 e 5 mg/l. Gli espianti primaverili si dimostrano più rispondenti e reattivi. Il materiale ‘forzato’ autunnali forzati a germogliare in acqua) risulta idoneo per le sue elevate capacità morfogeniche. Nella fase di messa in coltura di espianti primaverili, la zeatina (1mg/l) si rivela più efficace del BAP migliore nella fase di proliferazione. Tra le possibili fonti di carbonio il sorbitolo e il lattosio sembrano più efficienti del saccarosio nel favorire germogli ben sviluppati e vigorosi. Evidente l’effetto genotipico sulla capacità di adattamento alla coltura in vitro: alcuni genotipi quali Tonda Romana, Tonda Giffoni, Ghirarà, si sviluppano senza difficoltà a partire da tessuti prelevati nelle differenti fasi fenologiche delle piante madri; altri quali Nocchione, Piazza Armerina o S.M. del Gesù sembrano recalcitranti.


Linea di attività: “ASPARAGO”

1.  U.O. : Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Napoli (Responsabile Prof. Augusto PARENTE)

Titolo della ricerca: “Caratterizzazione biochimica e genetica di popolazioni di Asparagus acutifolius L. e valorizzazione della sua coltivazione”.

La sola specie coltivata di asparago è Asparagus officinalis mentre, tra quelle spontanee, Asparagus acutifolius, diffusa nell’areale mediterraneo, è particolarmente apprezzata per il suo delicato sapore, anche se difficilmente coltivabile.
Nell’ottica della caratterizzazione e della valorizzazione di specie e varietà locali di interesse agro-alimentare, abbiamo intrapreso: i) la ricerca, genetica e biochimica, di marcatori molecolari in A. acutifolius, utilizzabili per caratterizzare le popolazioni locali, preservarle dall’inquinamento di varietà non autoctone e promuoverne la valorizzazione; ii) la sperimentazione in vitro ed in vivo per valutare i parametri ottimali per la germinabilità di A. acutifolius.
La prima fase del progetto è consistita nella raccolta di popolazioni di Asparagus acutifolius in differenti regioni italiane. In particolare, i campionamenti di cladodi per l’analisi genetica sono stati condotti in Campania, Umbria, Molise, Sicilia, Sardegna, Liguria,  Puglia e Toscana mentre i turioni per l’analisi biochimica provengono, oltre che dalle sopraelencate regioni, anche da Lazio, Abruzzo, Calabria e Basilicata. I cladodi sono stati disidratati su gel di silice mentre i turioni sono stati conservati a –20°C. Al momento della raccolta, sono state annotate in schede preparate ad hoc: habitat, altitudine, esposizione, pedologia, aspetti vegetazionali, caratteristiche del popolamento, caratteristiche dei singoli esemplari (fenologia, sesso, presenza di semi).
Caratterizzazione genetica. Il primo approccio è stato l’analisi di marcatori RAPD, frammenti anonimi di amplificazione, in otto differenti popolazioni italiane. L’utilizzazione di sei differenti decameri con sequenza casuale per amplificare il DNA di 10 esemplari per ciascuna popolazione ha consentito di individuare frammenti di amplificazione ripetibili, unici e monomorfici per la maggior parte delle popolazioni in esame. In parallelo, è stato intrapreso l’isolamento e la caratterizzazione di loci microsatellitari. In A. acutifolius sono stati isolati e caratterizzati loci microsatellitari allestendo una libreria genomica parziale arricchita per ripetizioni GA/TC e GTT/CAA. La libreria è stata analizzata separatamente con oligonucleotidi (TC)13 e (AAC)10, marcati terminalmente ed i cloni positivi all’ibridazione sono stati sequenziati. Per 12 loci contenenti stringhe ripetute sono stati disegnati primer specifici, utilizzati per amplificare il DNA di 15 esemplari provenienti da una popolazione naturale campana di A. acutifolius. In sette loci (5 TC e 2 AAC) è stata evidenziata, tramite sequenziamento, variabilità di lunghezza delle sequenze ripetute.
Un ulteriore approccio alla caratterizzazione molecolare di popolazioni selvatiche di A. acutifolius è consistito nell’applicazione dell’analisi ISSR. Sono stati analizzati i profili di amplificazione di 42 primer ISSR in 8 popolazioni selvatiche. E’ stato possibile identificare marcatori specifici (monomorfici e/o polimorfici) per ciascuna delle popolazioni analizzate. L’analisi dei dati ha consentito di calcolare l’indice di fissazione (FST = 0,4561), che ha evidenziato un elevato livello di strutturazione genetica delle popolazioni, confermato anche dal punto di vista statistico dall’analisi AMOVA. L’albero di distanza UPGMA presenta rami che raggruppano gli esemplari di ciascuna popolazione, con un elevato valore di bootstrap (>50%). Si può quindi concludere che tali marcatori consentono di identificare e distinguere le popolazioni analizzate in base alla loro provenienza geografica.
Caratterizzazione biochimica
Inizialmente sono state effettuate analisi volte a determinare il contenuto totale di lipidi, amminoacidi liberi e proteine di A. acutifolius utilizzando, come riferimento, la specie coltivata A. officinalis. I risultati ottenuti hanno consentito di determinare differenze sostanziali tra le due specie con particolare riferimento al contenuto in amminoacidi liberi che mostra una netta prevalenza in A. acutifolius di asparagina (63%) e degli aa essenziali leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina nonché di prolina. Successivamente, è stata eseguita l’analisi delle proteine solubili su estratti ottenuti da turioni di popolazioni italiane di A. acutifolius provenienti da 12 regioni centro-meridionali.
L’analisi degli estratti proteici è stata condotta mediante elettroforesi mono- e bi-dimensionale (1D e 2D-PAGE), digitalizzazione dei pattern tramite densitometro scanner ed analisi d’immagine computerizzata. I dati ottenuti dai profili proteici mono- e bi-dimensionali dei turioni delle popolazioni di A. acutifolius hanno evidenziato un elevato grado di similitudine. Ciononostante, è stato possibile, in tutti i casi, identificare marcatori molecolari sia qualitativi che quantitativi capaci di discriminare tra le differenti popolazioni. Non sono stati individuati invece, fino ad ora, marcatori specifici idonei a distinguere univocamente ciascuna popolazione da tutte le altre.
L’indagine finalizzata all’identificazione di marcatori molecolari è stata successivamente estesa anche ad altre specie spontanee (A. albus) e coltivate (A. officinalis e A. scaber cv Montine) ugualmente presenti e diffuse sul territorio nazionale. In tal caso i profili proteici, sia mono- che bi-dimensionali, dei turioni hanno evidenziato significative differenze.
I risultati ottenuti dimostrano come sia estremamente agevole riconoscere le specie spontanee di asparago e distinguerle dalle specie coltivate. Ciò prospetta la concreta possibilità di impiegare i pattern proteici come una “carta d’identità molecolare” per rilevare rapidamente la presenza di una o dell’altra specie nei preparati alimentari.
Prove di germinazione in vitro ed in vivo. In una fase preliminare, è stata condotta una analisi morfo-funzionale dei semi di A. acutifolius ed A. officinalis. Per entrambe le specie sono state valutate la velocità e la capacità germinativa mediante curve di germinazione. Nel primo anno, le prove di germinazione in vitro hanno previsto pre-trattamenti chimici (esposizione a pH acidi e basici), meccanici (scarificazione della zona di emergenza della radice embrionale) e termici. Nessuno dei metodi utilizzati si è rivelato idoneo a innescare il processo germinativo nei semi di A. acutifolius, notoriamente dormienti .
Nel secondo anno, le prove di germinazione in vivo hanno previsto un periodo di vernalizzazione  ottenuto mediante stratificazione in sabbia umida (Rosati et al., 2000) per un arco di tempo di circa 3 mesi. Tale trattamento ha permesso di ridurre la post-maturazione dei semi di A. acutifolius, generalmente superiore ai 12 mesi, e nel contempo di incrementare la percentuale germinativa fino al 60%.
I risultati ottenuti fanno prevedere che sia possibile passare dalla raccolta spontanea alla coltivazione è possibile. 
Prove di trasformazione. E’stata avviata una sperimentazione per verificare la possibilità di ottenere prodotti trasformati da turioni di A. acutifolius  provenienti dalla Campania. In collaborazione con la Stazione Sperimentale per l’Industria delle Conserve Alimentari (SSICA) di Angri sono stati preparati i seguenti prodotti: i) conserva di punte di asparago all’acqua; ii) conserva di punte di asparago all’olio; iii) piatto pronto a base di asparago; iv) crema di asparago. Prove di degustazione hanno permesso di verificare la permanenza, sui quattro prodotti, delle proprietà gustative.



Linea di attività: “FRAGOLA”

1. U.O. Istituto di Ricerca sulle Biotecnologie Agroalimentari (IRBA), Lecce (Responsabile Dr. Giuseppe Zacheo)

Titolo della ricerca: Valorizzazione di ecotipi italiani di fragolina di bosco (Fragraria vesca L.) mediante analisi genetica e molecolare dell’aroma.

L’U.O. si è occupata della identificazione e caratterizzazione biochimica e molecolare delle attività enzimatiche che contribuiscono alle caratteristiche aromatiche gradevoli in frutti ad elevato valore commerciale.
Le ricerche sono state condotte su  Fragaria vesca (Elba, Alpine) e su Fragaria x ananassa (cv. Paros). I frutti di queste specie, raccolti allo stadio acerbo, invaiato e maturo sono stati utilizzati per le analisi chimiche, biochimiche, proteomica e molecolare.

Caratterizzazione quali-quantitativa delle principali componenti aromatiche che si sviluppano nel corso della maturazione
Sono state individuate le principali componenti volatili dell’aroma di fragolina di bosco presenti negli stadi di maturazione considerati ed i risultati sono stati confrontati con quelli della fragola commerciale. I risultati dimostrano che le componenti aromatiche principali in fragolina di bosco allo stadio acerbo sono C4 e C6 aldeidi e alcoli responsabili del caratteristico “odor di verde” (es. 2-methyl butanol, hexanal, hexanol, 2-hexenal). Questi prodotti permangono durante le prime fasi della maturazione del frutto in coincidenza con la  comparsa di alcuni esteri (es. ethyl acetate, 3-hexenol acetate, acetic acid hexyl ester). In frutti maturi la maggior parte delle sostanze volatili sono composti esterificati. Anche per la cv. Paros sono state riscontrate le stesse componenti aromatiche nei tre differenti stadi di maturazione. Tuttavia in fragolina di bosco è stata individuata una quantità maggiore di alcuni esteri.

Fingerprinting mediante cDNA-AFLP in frutti allo scopo di identificare marker molecolari associati a specifiche componenti aromatiche
È stata condotta l’analisi AFLP su cDNA ottenuto da frutti  di fragola coltivata (Fragaria x ananassa, cv. Paros) e di fragolina di bosco (Fragaria vesca, Alpine), raccolti a tre diversi stadi di maturazione (acerbo, invaiato e maturo). Il numero totale di frammenti analizzati è stato di circa 1200 e le dimensioni dei frammenti sono risultate comprese fra 38 e 450 bp. I risultati ottenuti hanno consentito di individuare frammenti polimorfici. Tali frammenti sono risultati essere non in comune fra la specie coltivata e quella selvatica e fra gli stadi di maturazione analizzati. I cDNA risultati polimorfici sia fra le specie in esame che fra gli stadi di maturazione sono stati caratterizzati. A tal scopo, gli AFLP ottenuti con le coppie di primer discriminanti, sono stati separati su gel di poliacrilammide al fine di poter ritagliare e sequenziare i frammenti polimorfici. Le sequenze dedotte, sono state in seguito confrontate con quelle di geni noti depositate in banca dati.
Il lavoro svolto ha consentito di individuare fingerprinting riproducibili della cv. Paros e della fragolina di bosco, Alpine. Inoltre, sono stati individuati diversi marcatori molecolari in grado di differenziare le due specie fra loro e nelle diverse fasi del processo di maturazione.

Identificazione di proteine differentemente espresse durante il processo di maturazione dei frutti (analisi proteomica)
Sono state sviluppate e confrontate mappe elettroforetiche bidimensionali complete e riproducibili delle proteine di frutti di fragola commerciale nei tre stadi di maturazione. L'analisi bioinformatica degli spot individuati in queste mappe ha rivelato la presenza di differenti polipeptidi nei diversi stadi di maturazione dei frutti. La sovrapposizione (matching) delle tre mappe ha mostrato che il 47% degli spot presenti nello stadio acerbo coincidevano con quelli presenti nello stadio maturo; una   sovrapposizione del 56% degli spot  è stata riscontrata comparando gli spot espressi nello stadio invaiato ed in quello maturo.
Le analisi di bioinformatica hanno consentito, inoltre, di individuare variazioni nel volume degli spot durante il processo di maturazione. E’ stata focalizzata l’attenzione sugli spot la cui intensità aumenta di almeno due volte tra lo stadio acerbo e quello maturo. E’ stato possibile individuare ed analizzare 28 spot che rispettavano queste caratteristiche
Tutti i 28 spots sono stati analizzati tramite MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight-Mass Spectrometry) oppure tramite ESI/MS/MS (Electrospray Ionisation Tandem Mass Spectrometry ). Tra gli spot analizzati 15 sono stati identificati come proteine presenti in banca dati. Delle quindici proteine identificate, 10 hanno una funzione correlata con la difesa allo stress ossidativo (cytosolic ascorbate peroxidase, due annexin-like protein RJ4, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase citosolica, quinone oxidoreductase, NAD(P)H dependent 6’-deoxychalcone synthase, NAD(P)H dependent 6’-deoxychalcone synthase,  due ripening induced protei, low molecular weight heat shock protein ), due, O-metilfransferasi e antocianidina sintasi, sono coinvolte, rispettivamente, nella biosintesi di aromi e di pigmenti, e tre sono state riconosciute come ripening induced proteins.

Identificazione e caratterizzazione di alcuni enzimi chiave coinvolti nelle vie metaboliche che portano alla biosintesi di alcune delle principali sostanze aromatiche
In estratti enzimatici di frutti di fragolina di bosco (var. Alpine) e di fragola commerciale (Cv. Paros) nei tre stadi di maturazione considerati, è stata studiata l’attività degli enzimi lipasi, lipossigenasi e idroperossido liasi, coinvolti nella biosintesi di aldeidi ed alcoli volatili a 6 atomi di carbonio. I risultati hanno indicato che le lipossigenasi (LOX) sono enzimi chiave di questa via. In fragola le LOX sono in grado di metabolizzare acido linolenico, linoleico ed il metil estere dell’acido linolenico, manifestando una maggiore affinità per l’acido linolenico ed il suo metil estere. L’attività specifica di questi enzimi è elevata nei primi stadi di maturazione e si riduce notevolmente nel frutto maturo. I prodotti dell’attività lipossigenasica sono idroperossidi degli acidi grassi. I risultati ottenuti hanno messo in evidenza la presenza degli acidi 9-e 13-idroperossioctadecadienoici (9- e 13-HPOD), e degli acidi 9-e 13-idroperossioctadecatrienoici (9- e 13-HPOT). Il rapporto fra gli  isomeri 9- e 13 è risultato essere all’incirca di 7:3.
E’ stato dimostrato che  differenti isoforme di LOX sono presenti durante il processo di maturazione dei frutti di fragola. Sono state identificate come LOX una proteina di circa 100 kDa, presente in tutte le fasi di maturazione ed una di circa 98 kDa rilevata negli estratti da frutti acerbi ed invaiati. L'analisi western blot sulle proteine totali separate mediante 2DE, ha indicato che un numero definito di proteine che reagiscono positivamente alla reazione anti-LOX è rilevabile nelle varie fasi di maturazione ed alcune di esse sono stadio-specifiche.
Le analisi effettuate mediante microscopia confocale ed elettronica, hanno permesso la localizzazione della proteina a livello del sistema di endomembrane e dei corpi lipidici delle cellule parenchimatiche del ricettacolo e nelle cellule presenti nei cotiledoni dell’achenio maturo.
Inoltre è stato clonato e sequenziato un cDNA di 2655bp di una lipossigenasi di fragola (la sequenza è stata immessa in banca dati EMBL con accession number AJ578035.1). Tale frammento codifica per un polipeptide putativo di 884 aa con peso molecolare di 97 kDa.
Lo studio dell’espressione di lox durante la maturazione ha messo in evidenza che l’espressione dell’enzima è presente nel ricettacolo del frutto in tutti e tre gli stadi, ma decresce durante la maturazione. Nell’acheno l’espressione LOX è invece costante nel corso dello sviluppo.
Anche l’attività lipasica è risultata essere elevata negli estratti dei frutti acerbi e ridotta negli stadi successivi. Al contrario, l’attività di HPL declina lievemente nel corso della maturazione. Da questi dati si evince che i tessuti di fragola a diverso stadio di maturazione metabolizzano l’acido linolenico e l’acido linolenico formando, rispettivamente, 2-esenale ed esanale componenti dell’aroma di fragola. Confrontando la quantità di esenale prodotta con la quantità di proteine, risulta che nei frutti di fragola la maggiore quantità di aldeide viene effettivamente prodotta nei primi stadi di maturazione.





Linea di attività “ALTRE SPECIE”
 
1. U.O. UTS Biotecnologie, Protezione della Salute e degli Ecosistemi, Roma (Responsabile Dr. Giovanni VITA (1° anno) e Dr. Paola CRINÒ (2° anno).

Titolo della ricerca: Identificazione delle risorse genetiche di specie orticole e frutticole impiegate per le produzioni tipiche mediterranee e valorizzazione delle caratteristiche salutistiche dei prodotti tipici ortofrutticoli

Tra i paesi europei con patrimonio agro-alimentare tutelato, l’Italia occupa un posto di rilievo con oltre 100 prodotti IGP o DOP e altri 3.600 circa riconosciuti come tradizionali dal decreto MiPAF del 14/6/2002 e successivi aggiornamenti. Limitando l’analisi alle produzioni di specie oggetto di studio da parte del progetto “SCRIGNO”, esistono attualmente 17 prodotti IGP/DOP, 258 tradizionali e 673 popolazioni autoctone di pomodoro, carciofo, asparago, fagiolo, fragola, ciliegia, arancia, limone, mandarino e nocciola.
Dal momento che, per alcuni di questi, non esiste un chiaro collegamento con le risorse genetiche autoctone a questi tradizionalmente afferenti ci si è proposti di realizzare un atlante multimediale che potesse raccogliere tutte le informazioni reperibili sui prodotti tipici e tradizionali italiani delle specie identificate. In questo atlante, si è mirato a identificare e valorizzare le combinazioni tra prodotto tipico locale e germoplasma autoctono impiegato per la sua produzione.
L’atlante è stato realizzato attraverso la ricerca di informazioni e dati relativi ai prodotti tipici/tradizionali e alle risorse genetiche autoctone delle specie coinvolte nel progetto, individuando le fonti più appropriate in funzione della tipologia dei prodotti. In particolare, consultando tecnici ed esperti del settore, siti Internet, istituzioni, riviste specializzate, materiale bibliografico, consorzi di tutela e associazioni di produttori. Sono state anche effettuate visite dirette a mostre e fiere e, presso l’Assessorato all’Agricoltura di ogni singola regione, sono state reperite le schede informative dei prodotti tradizionali; ove mancanti, sono state compilate schede ex-novo sulla base delle informazioni ricevute. Sono stati inoltre reperiti i disciplinari di produzione dei prodotti DOP/IGP, la normativa di riferimento sia a livello nazionale che comunitario e le mappe relative a popolazioni/varietà/cloni locali catalogate nell’ambito di studi sulle collezioni di germoplasma esistenti. Il materiale autoctono, impiegato o potenzialmente utilizzabile per la produzione dei prodotti ortofrutticoli tipici locali, è stato identificato (a) mediante sovrapposizione delle mappe relative alle aree di diffusione dei prodotti tipici e a quelle di presenza del germoplasma autoctono, (b) mediante consultazione dei disciplinari di produzione per i prodotti ortofrutticoli IGP e DOP e (c) mediante eventuali indagini presso esperti del settore o tecnici locali. Per ogni prodotto tipico, sono state sviluppate delle schede che evidenziano, ove possibile, l’attuale piattaforma varietale con una descrizione delle caratteristiche e della diffusione. Tutti i dati raccolti sono stati registrati su un supporto informatico per realizzare un atlante di documentazione multimediale che rappresenta, oltre ad una mappatura delle aree di diffusione dei prodotti tipici ortofrutticoli e di quelle di presenza delle popolazioni/cloni/varietà autoctone, l’archiviazione e accesso tramite link o da menu dei riferimenti di natura normativa, documentale, iconografica, fotografica, ecc.… relativi ai prodotti tipici e alle risorse genetiche a questi collegate. Lo strumento informatico è stato realizzato con i programmi MS Access, ArcView, Visual Basic, Cristal Report, Asp, compilando dapprima la banca dati e costruendo successivamente l’interfaccia di ricerca dei dati. Il database è stato quindi corredato con l’impostazione di link relativi a documenti esterni, a fotografie e cartografie e si è inoltre costruita l’interfaccia di consultazione dei prodotti. Per tutti i prodotti e le risorse genetiche autoctone inseriti nel supporto informatico, sono state create 1.448 cartografie suddivise secondo le seguenti tipologie:
mappe che indicano la zona di produzione dei prodotti tipici/tradizionali e la zona di diffusione delle varietà autoctone;
mappe di sovrapposizione tra prodotti e varietà che ricadono nello stesso territorio; la sovrapposizione tra aree di diffusione di prodotti tipici, prodotti tradizionali e varietà autoctone è stata realizzata una volta completato l’archivio informatizzato di tutti i prodotti e le varietà di interesse del progetto.

Sono state, inoltre,  reperite informazioni  relative alle sostanze naturali presenti in alcune specie di interesse per il progetto e con effetti positivi sulla salute umana; queste informazioni saranno implementate nella banca-dati. L’indagine sulle sostanze antiossidanti (resp. Dr. G. Vita) presenti in specie di interesse del progetto ha portato alle seguenti valutazioni:
il frutto di pomodoro contiene 29 diverse molecole, alcune delle quali fenoliche, come alanina (4-30 ppm), acido ascorbico (2,9-50 ppm), beta-carotene (7-113 ppm), acido clorogenico (18 ppm), licopene (1-20 ppm), acido palmitico (3,47-210 ppm), triptofano (1-1,2 ppm);
il frutto di arancio contiene sostanze che esplicano oltre 50 azioni  positive sulla salute umana, in particolare sulla prevenzione di alcuni tipi di cancro, sulla neuroattività positiva, come coadiuvante nella ipertensione e come battericida e fungicida;
il gruppo delle sostanze fenoliche naturali presenti in specie di piante eduli esplica oltre 25 tipi di azione biologica tra cui analgesica, antibatterica, anti-prostatica, antivirale, vasodilatatrice, preventiva verso il cancro.
Le piante d’interesse per il progetto aventi un maggior contenuto di fenoli sono state individuate in frutti di piante del genere Citrus, in ciliegio, carciofo, pomodoro e asparago.
Durante il 2° anno di attività, limitatamente ad alcune produzioni tipiche di carciofo “romanesco” (cloni di popolazioni originarie “Castellammare” e “Campagnano”), è stato determinato il contenuto di componenti importanti dal punto di vista nutrizionale e salutistico, quali i polifenoli, gli zuccheri e l’inulina. Alcuni cloni selezionati hanno mostrato un contenuto di polifenoli ed inulina significativamente più elevato rispetto alla media. In nocciolo, è stato determinato il contenuto di _-tocoferolo estratto da foglia di popolazioni italiane, per lo più laziali e campane. Il contenuto maggiore è stato trovato nelle popolazioni Avellana speciale, Piazza Armerina, Montebello, Nocciolo rosso, Tonda Giffoni e Tonda Romana. E’ stata inoltre sviluppata la metodologia di determinazione del tocoferolo da frutto di nocciolo.



Linea d’attività “CONFERENZA NAZIONALE”

1. U.O.: CNR- ISTITUTO PER IL MIGLIORAMENTO GENETICO DELLE PIANTE DA ORTO E DA FIORE  (Responsabile  Prof. Luigi Monti)

Nell’ambito del progetto SCRIGNO allo scopo di fare il punto sulle ricerche relative alla salvaguardia e valorizzazione degli ecotipi vegetali italiani, è stata organizzata la Conferenza Nazionale “Ecotipi Vegetali Italiani: una preziosa risorsa di variabilità genetica”. La Conferenza, tenutasi a Roma presso l’Aula Convegni del CNR nei giorni 6-7 Ottobre 2004, ha visto la partecipazione di centosettanta convenuti, rappresentanti del CNR, del MIUR, dell’Università, dell’Enea e delle Regioni. Nel corso delle due giornate sono state presentate ventitre comunicazioni orali e cinquantotto comunicazioni poster che sono state pubblicate negli appositi atti.
Le notizie relative alla Conferenza (format per la presentazione dell’abstract, scheda di registrazione, programma) sono state riportate nella pagina web che è stata creata e pubblicata in rete all’indirizzo www.pnragrobio.unina.it allo scopo di divulgare i risultati dei quattro progetti CNR/MIUR afferenti al  settore AGROBIOTECNOLOGIE: Allo scopo di procedere all’aggiornamento della pagina web, verranno a breve pubblicati i risultati ottenuti dalle singole UU.OO. del progetto SCRIGNO nel corso dei due anni di attività.


Dr. Giorgio ANCORA









Unità operative


Denominazione: ENEA UTS BIOTEC
Indirizzo: C.R. CASACCIA - Via Anguillarese - 00060 Roma
Referente: dr. Giorgio Ancora
Telefono/Fax: 06 30483254
e-mail: Ancora@casaccia.enea.it


Denominazione: CNR - Istituto di Genetica Vegetale, Sezione di Perugia
Indirizzo: Via della Madonna Alta 130 - 06128 Perugia
Referente: dr. Sergio Arcioni
Telefono/Fax: 075 5014811 / 075 5014869
e-mail: S.Arcioni@irmgpf.pg.cnr.it


Denominazione: ENEA UTS BIOTEC
Indirizzo: Via Anguillarese 301 - 00064 S. Maria di Galeria (RM)
Referente: dr. Loretta Bacchetta
Telefono/Fax: 06 30483634
e-mail: loretta.bacchetta@casaccia.enea.it


Denominazione: CNR - Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria (IBBA)
Indirizzo: Via Bassini 15 - 20133 Milano
Referente: dr. Diego Breviario
Telefono/Fax: 02 23699441 / 02 23699411
e-mail: breviario@ibba.cnr.it / gianis@ibv.mi.cnr.it


Denominazione: Università degli Studi di Firenze - Dipartimento di Biologia Animale e Genetica
Indirizzo: Via Romana, 17/19 - 50125 Firenze
Referente: prof. Marcello Buiatti
Telefono/Fax: 055 2288237 / 055 2288250
e-mail: mbuiatti@dbag.unifi.it


Denominazione: ENEA UTS BIOTEC
Indirizzo: Via Anguillarese 301 - 00060 S. Maria di Galeria (RM)
Referente: prof. Giovanni Giuliano
Telefono/Fax: 06 30483192 / 06 30483215
e-mail: giulianog@casaccia.enea.it


Denominazione: CNR - Istituto di Genetica Vegetale, Sede di Bari
Indirizzo: Via G. Amendola, 165/A - 70126 Bari
Referente: dr. Gaetano Laghetti
Telefono/Fax: 080 5583400 / 080 5587566
e-mail: germgl03@area.ba.cnr.it


Denominazione: ENEA UTS BIOTEC
Indirizzo: Via Anguillarese 301 - 00060 S. Maria di Galeria (RM)
Referente: dr. Sergio Lucretti
Telefono/Fax: 06 30483191 / 06 30484498
e-mail: lucretti@casaccia.enea.it


Denominazione: Università degli Studi della Tuscia - Dipartimento di Agrobiologia e Agrochimica
Indirizzo: Via S. Camillo de Lellis snc - 01100 Viterbo
Referente: dr. Andrea Mazzucato
Telefono/Fax: 0761 357221 / 0761 357242
e-mail: mazz@unitus.it


Denominazione: CNR - Istituto di Genetica Vegetale, Sezione di Portici
Indirizzo: Via Università 133 - 80055 Portici (NA)
Referente: prof. Luigi Monti
Telefono/Fax: 081 2539027 / 081 7753579
e-mail: lmonti@unina.it


Denominazione: II Università degli Studi di Napoli - Dipartimento di Scienze della Vita
Indirizzo: Via Vivaldi 43 - 81100 Caserta
Referente: prof. Augusto Parente
Telefono/Fax: 0823 274583 / 0823 274571
e-mail: augusto.parente@unina2.it


Denominazione: CNR - Istituto di Genetica Vegetale, Sede di Bari
Indirizzo: Via G. Amendola 165/A - 70126 Bari
Referente: dr. Gabriella Sonnante
Telefono/Fax: 080 5583608 - 5580971 / 080 5585861
e-mail: germgs15@area.ba.cnr.it


Denominazione: CNR - Istituto per la Valorizzazione del Legno e delle Specie Arboree
Indirizzo: Via Ponte di Formicola 76 - 50018 Scandicci (FI)
Referente: prof. Giancarlo Roselli
Telefono/Fax: 055 754718 - 754280 -750340 / 055 755121
e-mail: roselli@ipsl.fi.cnr.it


Denominazione: Università degli Studi della Tuscia
Indirizzo: Via S. Camillo de Lellis snc - 01100 Viterbo
Referente: prof. Francesco Saccardo
Telefono/Fax: 0761 357369 / 0761 357531
e-mail: saccardo@unitus.it


Denominazione: Università della Basilicata - Dipartimento Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali
Indirizzo: Campus Macchia Romana - 85100 Potenza
Referente: prof. Pier Luigi Spagnoletti Zeuli
Telefono/Fax: 0971 205536-33 / 0971 205514
e-mail: spagnoletti@unibas.it


Denominazione: Università degli Studi della Tuscia - Dipartimento di Agrobiologia e Agrochimica
Indirizzo: Via S. Camillo de Lellis snc - 01100 Viterbo
Referente: prof. Oronzo Antonio Tanzarella
Telefono/Fax: 0761 357312 / 0761 357256
e-mail: tanzarel@unitus.it


Denominazione: CNR - Istituto di Genetica Vegetale, Sezione di Palermo
Indirizzo: Viale delle Scienze - 90128 Palermo
Referente: dr. Nicasio Tusa
Telefono/Fax: 091 6574578 / 091 423424
e-mail: cmga@unipa.it - ntusa@unipa.it


Denominazione: Università degli Studi di Perugia - Dipartimento di Biologia Vegetale e Biotecnologie Agroambientali - Sez. Genetica e Miglioramento Genetico
Indirizzo: Borgo XX Giugno 74 - 06121 Perugia
Referente: prof. Fabio Veronesi
Telefono/Fax: 075 58562078 / 075 5856224
e-mail: veronesi@unipg.it


Denominazione: ENEA UTS BIOTEC
Indirizzo: C.R. Casaccia - Via Anguillarese 301 - 00060 Roma
Referente: dr. Giovanni Vita
Telefono/Fax: 06 30483453 / 06 30486545
e-mail: gianni.vita@casaccia.enea.it


Denominazione: CNR - Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA) - Sezione di Lecce
Indirizzo: Via Prov.le Lecce-Monteroni - 73100 Lecce
Referente: dr. Giuseppe Zacheo
Telefono/Fax: 0832 / 420000
e-mail: giuseppe.zacheo@irba.le.cnr.it










Budget



VALORE
FINANZIAMENTO MIUR
COFINANZIAMENTO UU.OO.
€ 1.549.370,70
€ 1.032.913,80
€ 516.456,90











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